趙振東，李嘉誠，馮玉紅，孟曉靜，金彪

(海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，?？?570228)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法鑒別十字花科植物中硫代葡萄糖苷＊

趙振東，李嘉誠，馮玉紅，孟曉靜，金彪

(海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，?？?570228)

建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法鑒別十字花科植物中硫代葡萄糖苷的分析方法。采用70%甲醇水溶液提取白芥種子中的硫代葡萄糖苷，通過反相C18柱分離，電噴霧-離子阱-飛行時間質(zhì)譜測定。利用硫代葡萄糖苷二級質(zhì)譜裂解產(chǎn)生的m/z 195，241，259，275，291特征離子和伴隨產(chǎn)生的80，162，163，196，242 Da中性分子丟失規(guī)律，共鑒別出5種硫代葡萄糖苷。

硫代葡萄糖苷；十字花科；液相色譜；質(zhì)譜

硫代葡萄糖苷(簡稱硫苷)是廣泛存在于十字花科植物中的含硫次級代謝產(chǎn)物，主要分布于植物的根、莖和葉中。當(dāng)植物細(xì)胞受到破壞(如擠壓、蟲咬等)后，硫苷與植物內(nèi)生的黑芥子酶接觸，降解產(chǎn)生異硫氰酸酯、惡唑烷酮和硫氰酸酯等化合物［1］，其中異硫氰酸酯具有良好的生物活性，而且對人畜無害。因此硫苷及其降解產(chǎn)物的研究引起了科學(xué)工作者的濃厚興趣。根據(jù)側(cè)鏈R基團的不同，目前已發(fā)現(xiàn)約120種硫苷，其中有多種具有抗癌、抗腫瘤、殺菌和殺蟲活性的異硫氰酸酯，如吳華等［2］比較幾種異硫氰酸酯的殺線蟲活性，發(fā)現(xiàn)烯丙基和丙烯?；惲蚯杷狨ゾ哂辛己玫臍⒕€蟲活性。大量研究表明甲硫基己基異硫氰酸酯等具有良好的抗腫瘤活性，是非常具有潛力的抗癌藥物［3-6］。

硫苷的檢測方法主要是傳統(tǒng)的化學(xué)方法和現(xiàn)代的儀器分析手段。化學(xué)方法耗時、誤差大、操作繁瑣，只能測定硫苷總量。液相色譜法具有很高的分離效率，但對于硫苷單體鑒別需要對照品，無法滿足快速鑒別硫苷的需要。筆者采用超高效液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，既能高效分離硫苷，又能準(zhǔn)確、快速鑒別硫苷。對于硫苷及降解產(chǎn)物的研究具有重要意義，同時又能夠提高工作效率。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜儀：LCMS-IT-TOF型，日本島津公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-6型，常州澳華儀器有限公司；

真空干燥箱：VD23型，德國BINDER公司；電子天平：AUY220型，日本島津公司；

超聲波清洗器：KS-120EI型，寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-216型，瑞士BUCHI公司；臺式高速離心機：H-1650型，長沙湘儀離心機儀器有限公司；

研磨機：A11基本型，德國IKA公司；

白芥種子：產(chǎn)地為湖北武漢；

正己烷、氯仿、乙酸銨、甲酸：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

甲醇：色譜純，美國Fisher公司；

實驗用水為美國Pall公司Purelab Ultra超純水系統(tǒng)制備的超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm。

1.2 硫代葡萄糖苷提取［7-8］

白芥種子在105℃干燥3 h，以滅活黑芥子酶保護(hù)硫苷。干燥種子經(jīng)粉碎后，過420 μm篩。稱取粗粉約50 g于錐形瓶中，依次用正己烷50 mL，氯仿50 mL 各3次除脂。殘渣經(jīng)真空干燥，用300 mL沸騰的70%甲醇水溶液浸泡，超聲提取30 min，連續(xù)2次，合并提取液，靜置至室溫。提取液經(jīng)離心分離，將清液真空下濃縮至原體積的20%。取1 mL濃縮液經(jīng)石墨化碳脫色，濾液供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.3 流動相配制

用電子天平準(zhǔn)確稱量乙酸銨0.385 g，置于1 L量瓶中，加入1 mL甲酸，用水溶解定容后，經(jīng)0.22 μm微膜過濾，超聲波脫氣后使用。

1.4 液質(zhì)聯(lián)用分析條件

（1）UPLC條件

ODS C18柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm，日本島津公司)；柱溫：30℃；流動相A：5 mmol/L乙酸銨-1‰甲酸溶液；流動相B：甲醇；流動相流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL；梯度洗脫：0～3 min，98% A；3～25 min，98%～20% A；25～30 min，20%～20 % A；30～35 min，20%～98% A。

（2）MS條件

ESI負(fù)離子模式；電壓：-3.5 kV；霧化氣：N2，流量為1.5 L/min；干燥氣壓力：100 kPa；碰撞氣：Ar；檢測器電壓：1.7 kV；Heat Block溫度：200℃；CDL溫度：200℃；一級質(zhì)譜掃描范圍：m/z 300～700；母離子掃描范圍：m/z 315～650；二級質(zhì)譜掃描范圍：m/z 50～700；離子累積時間：10 ms；CID碰撞能量：100%；碰撞氣能量：100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件選擇

硫苷在水溶液中是親水性陰離子化合物，在反相色譜柱中，保留時間短。優(yōu)化實驗發(fā)現(xiàn)，在ODS-C18柱上采用流動相A(5 mmol/L的乙酸銨+0.1%甲酸)和流動相B(甲醇)能夠很好分離，并且有很好的質(zhì)譜響應(yīng)。質(zhì)譜Heat Block和CDL溫度采用200℃，溫度過高會造成硫苷裂解，過低則影響離子化和脫溶劑化效果。為獲得比較豐富的二級離子碎片信息，CID碰撞能量和碰撞氣能量均采用100%。

2.2 分析結(jié)果

按照1.4分析條件檢測白芥種子提取液，獲取硫苷提取離子流色譜圖及其一、二級質(zhì)譜圖(見圖1～圖11)。根據(jù)裂解機理，并參考文獻(xiàn)［9-12］，共鑒定出5種硫苷，結(jié)果見表1。

圖1 白芥種子中硫代葡萄糖苷的提取離子流色譜圖

圖2 progoitrin一級質(zhì)譜圖(MS1)

圖3 progoitrin二級質(zhì)譜圖(MS2)

圖4 Sinigrin一級質(zhì)譜圖(MS1)

圖5 Sinigrin二級質(zhì)譜圖(MS2)

圖6 Gluconapin一級質(zhì)譜圖(MS1)

圖7 Gluconapin二級質(zhì)譜圖(MS2)

圖8 Glucobrassicanapin一級質(zhì)譜圖(MS1)

圖9 Glucobrassicanapin二級質(zhì)譜圖(MS2)

圖10 Gluconasturtiin一級質(zhì)譜圖(MS1)

圖11 Gluconasturtiin二級質(zhì)譜圖(MS2)

2.3 質(zhì)譜碎片離子裂解機理

二級質(zhì)譜特征離子，對于鑒別硫苷具有重要意義。在MS2中，母離子先后失去SO3(80 Da)和C6H10O5(162 Da)后產(chǎn)生242 Da中性分子丟失，氫重排后出現(xiàn)相對應(yīng)的R—C(SH)=N—O—離子。另一裂解途徑是硫苷上的氫發(fā)生重排后，失去C6H11O5(163 Da)和C6H12O5S(196 Da)中性碎片。與此同時，二級質(zhì)譜中還能觀察到m/z 195，241，259，275，291的特征離子，這些離子是由于硫與相鄰碳原子發(fā)生斷裂，并伴有氫重排形成的。

硫代葡萄糖苷負(fù)離子模式下主要特征二級碎片離子裂解機理見圖12［13-14］。

3 結(jié)語

利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)快速、高效、準(zhǔn)確的分離與鑒定十字花科植物中硫代葡萄糖苷，對硫代葡萄糖苷二級質(zhì)譜80，162，163，196，242 Da中性分子丟失和m/z 195，241，259，275，291特征離子裂解機理進(jìn)行了闡述和總結(jié)，能夠準(zhǔn)確推測硫代葡萄糖苷化學(xué)結(jié)構(gòu)，對于十字花科植物的開發(fā)與利用具有重要意義。

［1］Luca Lazzeri，Giovanna Curto，Onofrio Leoni，et al. Effects of glucosinolates and their enzymatic hydrolysis products via myrosinase on the root-knot nematode meloidogyne incognita (kofoid et white)chitw［J］. J Agric Food Chem，2004，52: 6 703-6 707.

表1 白芥種子中硫苷主要二級質(zhì)譜離子表

圖12 硫代葡萄糖苷質(zhì)譜裂解規(guī)律示意圖

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Separation and Identification of Glucosinolates in the Cruciferae Crops by UPLC-MS/MS

Zhao Zhendong，Li Jiacheng，F(xiàn)eng Yuhong，Meng Xiaojing，Jin Biao
(Materials and Chemical Engineering of Hainan University，Haikou 570228, China)

A method for precise identification of glucosinolates in the Cruciferae Crops by UPLC-MS/MS was established. The glucosinolates were extracted with methanol-water (volume ratio 70∶30)，while the separation and qualitative determination of the individual glucosinolates was achieved using RP-UPLC-ESI-IT-TOF. The glucosinolates was confirmed with the use of product ions at m/z 195，241，259，275，291 in MS2. Further identification of the five glucosinolates was based on the detection of compounds with a constant neutral loss of 80, 162, 163, 196, 242 Da in collision-induced dissociation.

glucosinolate; cruciferae; liquid chromatography; mass spectrometry

O657.63

A

1008-6145(2013)02-0012-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2013.02.003

*“十二五”科技支撐計劃（2011BAE06B06-7，2011BAE06B04-7）；海南大學(xué)青年基金項目（qnjj1220）

聯(lián)系人：馮玉紅；E-mail: ljcfyh@263.net

2012-12-12