吳煥榮 趙全興 楊欣欣 楊慧玲 國(guó) 琳（山東眾成飼料科技有限公司 山東省禽用飼料工程技術(shù)研究中心 山東 肥城 271600）

潘志剛 （山東省煙臺(tái)市萊山區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所）

雞傳染性貧血病LAMP檢測(cè)方法的建立

吳煥榮*趙全興 楊欣欣 楊慧玲 國(guó) 琳（山東眾成飼料科技有限公司 山東省禽用飼料工程技術(shù)研究中心 山東 肥城 271600）

潘志剛 （山東省煙臺(tái)市萊山區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所）

本文借助環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，建立了雞傳染性貧血病的快速檢測(cè)方法。通過(guò)提取DNA模板，設(shè)計(jì)特異性LAMP引物，成功擴(kuò)增出梯形條帶。結(jié)果表明，LAMP能檢測(cè)出最低DNA量約為0.245pg/μl，而PCR能檢測(cè)出最低DNA量約為2.45pg/μl；且具有特異性，對(duì)其他相關(guān)雞病病原檢測(cè)結(jié)果均為陰性。用建立的LAMP方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與PCR方法比較，結(jié)果表明LAMP檢測(cè)的陽(yáng)性率要比PCR高。LAMP檢測(cè)方法無(wú)需昂貴設(shè)備，適用于雞場(chǎng)的臨床快速診斷。

雞傳染性貧血病毒 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) PCR 檢測(cè)

雞傳染性貧血病(Chicken Infectious Anemia，CIA)是由雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus, CIAV)引起雛雞的以再生障礙性貧血和全身性淋巴組織萎縮為特征的一種免疫抑制性疾病，經(jīng)常合并、繼發(fā)和加重病毒、細(xì)菌和真菌性感染，危害很大[1,2]。國(guó)內(nèi)外的病原分離和血清學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，雞傳染性貧血病可能呈世界性分布，由雞傳染性貧血病毒誘發(fā)的疾病已成為一個(gè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)問(wèn)題，特別是對(duì)肉雞的生產(chǎn)[3,4]。

目前針對(duì)該病的診斷方法有ELISA、DNA探針、常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)PCR等，這些診斷方法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求比較高，而且對(duì)操作者要求具有很好的專(zhuān)業(yè)背景，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是由日本Notomi等在2000年開(kāi)發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法[5]，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)四種特異引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下高效擴(kuò)增核酸，具有高特異性、快速靈敏、高效、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。LAMP方法是一種新型的DNA環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊的儀器設(shè)備，只需要用普通的水浴鍋就可以完成整個(gè)診斷過(guò)程，而PCR反應(yīng)程序比較復(fù)雜，反應(yīng)時(shí)間較LAMP反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，而且LAMP檢測(cè)的靈敏度遠(yuǎn)高于PCR，本文研究利用LAMP技術(shù)診斷這種疾病。

1 試驗(yàn)材料

1.1 材料 CIAV標(biāo)準(zhǔn)毒CuX-1株(M55918)由公司實(shí)驗(yàn)室保存，ALV毒株由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)予。pTCIAV陽(yáng)性克隆、ALV陽(yáng)性克隆均由公司實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑和儀器 Bst DNA聚合酶，大片段(New England Biolabs)；普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒；Pst I 限制性?xún)?nèi)切酶,SYBR Green染色液；Tris-HCl，EDTA；NaCl；SDS；Betaine(5mol/L)購(gòu)自Sigma公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Sigma公司；pGEM-T easy VectorKit購(gòu)自Invitrogen公司；PCR反應(yīng)試劑、限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自Takara公司；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA片段回收試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞E.coli.Top10菌株購(gòu)自北京天根科技有限公司；PCR儀、水浴鍋等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 模板的制備 CIAV DNA的提取：取CIAV病料液100μl加入20μl的裂解液(10mmol/L，Tris-HCl；1mmol/L，EDTA；15mmol/L，NaCl；0.5%，SDS)，震蕩混勻后，煮沸10min，最后12000r/min4℃離心10min，取上清作為模板，進(jìn)行LAMP。

2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的雞傳染性貧血病毒基因序列(Cux-1：M55918)中的保守區(qū)運(yùn)用Primer Explorer Version 3設(shè)計(jì)兩套特異性的LAMP引物，包括兩條外引物F3、B3和兩條內(nèi)引物FIP、BIP，另外為了加速反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時(shí)間設(shè)計(jì)了LF、LB環(huán)引物，其中為了確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，使用限制內(nèi)切酶Pst I進(jìn)行酶切，識(shí)別F2和F1c之間的位點(diǎn)，產(chǎn)生的片段與推測(cè)的大小(184bp和221bp)相符。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

2.3 LAMP擴(kuò)增反應(yīng)條件 CIAV LAMP反應(yīng)體系25μl，包括：dNTPs 1.6mmol/l、FIP/BIP 1.6umol/l、F3/B3 1.6umol/l、LF/LB 0.4umol/l、Betaine(5mol/L)，5.0μl、MgCl2(25mmol/l)，2.5μl、Bst DNA聚合酶大片段2μl、10×ThermoPolbuffer 2.5μl、DNA模板2μl，加雙蒸水補(bǔ)足至25μl；混勻后63℃溫浴30min，85℃滅活5min；產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.4 CIAV LAMP產(chǎn)物酶切鑒定 LAMP產(chǎn)物按照天根公司普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化。20μl的酶切體系包括：純化的DNA 5μl；10×buffer 2μl；Pst I 2μl；雙蒸水11μl。37℃恒溫12h，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察結(jié)果。

2.5 LAMP反應(yīng)的特異性實(shí)驗(yàn) 取5種病原包括雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生病毒(REV)、雞新城疫病毒(NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽白血病病毒(ALV)的DNA或cDNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。

2.6 LAMP反應(yīng)靈敏度的檢驗(yàn) 取CIAV全基因組克隆陽(yáng)性克隆pTCIAV，搖菌12-16h后，提取質(zhì)粒，測(cè)定OD260nm處的吸光值，換算為核酸含量，然后10倍系列稀釋?zhuān)飨♂尪葹槟０宸謩e進(jìn)行PCR和LAMP擴(kuò)增。

2.7 LAMP與PCR檢測(cè)方法的對(duì)比及臨床樣品檢測(cè) 設(shè)計(jì)合成用于CIAV的PCR檢測(cè)的一系列引物，按照已建立的CIAV的PCR檢測(cè)步驟對(duì)10倍稀釋的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，并與LAMP的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。用上述兩種方法對(duì)所采集的40份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 LAMP檢測(cè)方法的建立 以本研究設(shè)計(jì)的兩套特異性引物分別對(duì)雞傳染性貧血病毒(Cux-1∶M55918)基因組DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1、2，結(jié)果顯示以CIAV DNA為模板的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)生階梯狀條帶，以及CIAV LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切結(jié)果。

圖1 雞傳染性貧血病病毒LAMP產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

圖2 雞傳染性貧血病病毒LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物Pst I酶切鑒定

3.2 反應(yīng)結(jié)束后，向產(chǎn)物中加入1μl SYBR GreenI染料，自然光下CIAV 陽(yáng)性管呈綠色，而陰性管仍為染料原色橙色；紫外燈下CIAV陽(yáng)性管呈現(xiàn)明顯的熒光，而陰性管則無(wú)特異性熒光(圖3)。

圖3 雞傳染性貧血病病毒LAMP產(chǎn)物染色反應(yīng)

3.3 LAMP檢測(cè)CIAV的特異性試驗(yàn) 用建立的LAMP方法分別以IBDV、REV、NDV、IBV和ALV的DNA或cDNA為模板進(jìn)行LAMP特異性檢測(cè)，按照優(yōu)化后的LAMP體系進(jìn)行63℃等溫?cái)U(kuò)增，取反應(yīng)后的產(chǎn)物5μl用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果僅以CIAV的DNA為模板可擴(kuò)增出LAMP特征性梯形條帶，而對(duì)照病原均為陰性(見(jiàn)圖4)，表明LAMP檢測(cè)方法對(duì)CIAV的檢測(cè)有良好的特異性。

3.4 LAMP檢測(cè)CIAV的敏感性試驗(yàn) 將提取的DNA(濃度為0.245μg/ml)10倍稀釋至10-4，分別進(jìn)行PCR和LAMP檢測(cè)(圖5、6)。結(jié)果表明，LAMP能檢測(cè)出最低DNA量約為0.245pg/μl，而PCR能檢測(cè)出最低DNA量約為2.45pg/μl。 3.5 LAMP臨床樣品檢測(cè) 利用PCR和LAMP分別對(duì)送檢的40份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，PCR方法檢出8份陽(yáng)性，LAMP方法檢出12份陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率分別為20%和30%，表明LAMP方法較PCR方法更為敏感。

圖4 LAMP方法檢測(cè)CIAV的特異性試驗(yàn)

圖5 PCR方法檢測(cè)CIAV的敏感性試驗(yàn)

圖6 LAMP方法檢測(cè)CIAV的敏感性試驗(yàn)

4 討論

（1）當(dāng)前，在我國(guó)集約化程度高的大型雞場(chǎng)中的雞群中普遍存在著不同免疫抑制性病毒感染，而且不同形式的免疫抑制性疾病已對(duì)我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)特別是肉雞生產(chǎn)帶來(lái)很大威脅。家禽免疫抑制性病原體有很多種，除了馬立克氏病毒(MDV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、雞傳染性貧血病毒(CIAV)外，J亞群白血病病毒(ALV-J)、網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生病毒(REV)和呼腸孤病毒(Reovirus)感染機(jī)體皆可引起胸腺、法氏囊及其他淋巴細(xì)胞嚴(yán)重缺失[6,7]，降低機(jī)體的免疫功能。其中CIAV病毒既能通過(guò)種蛋垂直傳播，又可在雞群內(nèi)水平傳播，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害嚴(yán)重，為及時(shí)診斷該病，急需發(fā)展快速、靈敏、準(zhǔn)確而且操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)技術(shù)來(lái)滿(mǎn)足基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要[8]。（2）LAMP方法在病原的診斷方面呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，是一種新的核酸診斷技術(shù)。目前，已經(jīng)開(kāi)展了應(yīng)用LAMP技術(shù)對(duì)多種病原微生物的檢測(cè)[9,10]，包括西尼羅河熱病毒、日本腦炎病毒、裂谷熱病毒、口蹄疫病毒等。（3）本研究建立了一種針對(duì)CIAV的LAMP快速檢測(cè)方法。首先根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物，合適的引物對(duì)于LAMP反應(yīng)的成功至關(guān)重要，特異性的區(qū)域保證了反應(yīng)的特異性，引物的正確結(jié)構(gòu)保證了莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA的形成和延伸。使用CIAV的DNA為模板，測(cè)試引物的擴(kuò)增效率和對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，Mg2+、dNTPs、Betaine和反應(yīng)時(shí)間、溫度都對(duì)LAMP的結(jié)果有影響。該方法敏感性高，可檢測(cè)到0.2pg/μl；特異性強(qiáng)，對(duì)IBDV、REV、NDV、IBV和ALV等的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。應(yīng)用建立的LAMP方法，對(duì)送檢的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為30%，較普通PCR高，表明LAMP方法敏感性高。（4）本研究中LAMP方法與常規(guī)PCR檢測(cè)方法相比有顯著的優(yōu)點(diǎn)，首先LAMP成本低廉，利用BstDNA聚合酶在63℃實(shí)現(xiàn)等溫?cái)U(kuò)增，不需要昂貴的PCR儀；其次是反應(yīng)迅速，可以在1h內(nèi)完成反應(yīng)，而一般的PCR至少需要2～3h；然后是通過(guò)反應(yīng)后向產(chǎn)物中加入熒光指示劑，肉眼在自然光或紫外光下可直接觀測(cè)結(jié)果，避免了電泳過(guò)程中的污染。（5）LAMP技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、特異，無(wú)需貴重檢測(cè)設(shè)備而易普及等優(yōu)點(diǎn)。本方法適于在基層推廣、應(yīng)用，在生產(chǎn)中發(fā)揮其應(yīng)有的快速檢測(cè)作用。如果進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化和完善，該技術(shù)將會(huì)在CIAV的診斷及預(yù)防控制方面發(fā)揮巨大作用，從而為獸醫(yī)臨床診斷與治療提供參考。

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A

1007-1733(2013)10-0018-03

2013–05–29）

山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2011GNC11113)；泰安市科技發(fā)展計(jì)劃專(zhuān)項(xiàng)計(jì)劃(20113061)

*通訊作者