申 穎 李兆華 王成森 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）

壽光雞中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒的分離鑒定

申 穎 李兆華 王成森 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）

對(duì)發(fā)生腫瘤的某壽光雞群隨機(jī)抽取10只雞接種雞胚成纖維細(xì)胞進(jìn)行針對(duì)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒(REV)的分離和鑒定。分離到2株REV，對(duì)2株REV的env基因進(jìn)行了擴(kuò)增、克隆和序列分析，結(jié)果顯示，2株REV之間的env基因核酸同源性為99.8%，與分離自中國黑龍江的HLJR0901和分離自中國臺(tái)灣的Chicken/3337/05親緣關(guān)系最近。

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒 病毒分離鑒定 序列比較

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(Reticuloendotheliosis，RE)是禽類的一種重要的致腫瘤性疾病，其病原禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒(Reticuloendotheliosis virus, REV)是一個(gè)禽反轉(zhuǎn)錄病毒群，是禽白血病毒(Avian Leukosis Virus, ALV)、馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)之后第三種引起禽類發(fā)生腫瘤的病毒，不僅感染雞，還可以感染火雞、鴨、鵝、鵪鶉和野雞等[1]。REV主要誘發(fā)雞急性網(wǎng)狀細(xì)胞腫瘤、淋巴組織和其它組織的慢性腫瘤等。

除腫瘤外REV還可導(dǎo)致感染禽類胸腺、法氏囊等免疫器官發(fā)生萎縮，形成免疫抑制，降低了免疫應(yīng)答，對(duì)其它病原體的敏感性增強(qiáng)，生產(chǎn)性能下降。禽通?？山?jīng)垂直傳播、水平傳播以及經(jīng)注射了被REV污染的活疫苗而感染，但很少出現(xiàn)腫瘤，多呈現(xiàn)抗體陽性。近年來，我國雞群中REV的血清抗體陽性率逐漸增高，特別是在地方品系雞中極為明顯[2,3]，顯示地方品系雞中仍存在REV感染的巨大風(fēng)險(xiǎn)。本研究即從山東省地方品系壽光雞中分離鑒定了2株REV并對(duì)其env基因進(jìn)行了測序分析。

1 材料與方法

1.1 病料來源與背景

2013年3月，山東濰坊某雞場飼養(yǎng)的商品代壽光雞發(fā)生腫瘤病例，剖檢可見肝臟和脾臟有腫瘤，隨機(jī)抽取50只雞翅靜脈采血，分離血清后分別用Reticuloendotheliosis Virus Antibody Test Kit(IDEXX Laboratory，USA)按照說明書檢測REV血清抗體，有17份血清樣品顯示REV抗體陽性。懷疑本雞群存在REV感染。

1.2 病毒的分離鑒定

從雞群中隨機(jī)抽取10只雞，每只雞均無菌靜脈采集抗凝血1ml，1500r/min，離心2min后取血漿接種于已長成單層的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中提前放入滅菌的蓋玻片。接種后細(xì)胞在37℃孵育1h后棄掉培養(yǎng)液，更換為含1%胎牛血清(GIBCO，USA)的DMEM維持液，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)6d。盲傳1代維持6d后收集培養(yǎng)上清液凍存于-80℃?zhèn)溆?，培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片以丙酮與乙醇冰(3∶2)混合液固定5min。然后以針對(duì)REV單克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)檢測[4].

1.3 分離毒株env基因的擴(kuò)增、克隆和測序

1.3.1 模板DNA的提取 CEF在接種REV維持6d后收獲細(xì)胞，經(jīng)洗滌、離心沉淀再用抽提緩沖液(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl pH8.0，25mmol/L EDTA pH8.0，0.5%SDS)懸浮后，加入蛋白酶K(100ug/ml)消化過夜，再用苯酚抽提和乙醇沉淀后，溶解于TE(10mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA，pH8.0)中即為樣品模板DNA(50ng/μl-100ng/μl)。

1.3.2 env基因的PCR擴(kuò)增 參照已發(fā)表的文獻(xiàn)合成了一對(duì)引物用于擴(kuò)增分離毒株的env基因[5]。反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)配置，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃，60s.55℃，50s，72℃，2min；33個(gè)循環(huán)；72℃，10min。以正常CEF基因組DNA作為陰性對(duì)照。

1.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和測序 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳鑒定并將目的條帶切下以E.Z.N.A Gel Extraction Kit(OMEGA，USA)回收純化DNA，將純化DNA連接PMD-18T Vector (TaKaRa，大連)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，隨機(jī)挑取菌落以Plasmid Mini Kit (OMEGA，USA)提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，選取鑒定為陽性克隆子送上海生工生物工程有限公司測序，序列以DNAStar軟件進(jìn)行分析。

1.4 不同分離株的準(zhǔn)種比較及其分子演化

為分析所分離毒株的分子演化趨勢，選取來源于雞、鴨、鵝等不同物種的REV參考毒株的env基因進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化分析，參考毒株及GenBank登錄號(hào)見表1。

表1 用于env氨基酸序列比較所用REV參考株及其GenBank登錄號(hào)

2 結(jié)果

2.1 REV的分離鑒定

IFA檢測結(jié)果表明有2份樣品顯示REV陽性，與未感染的樣品相比，陽性樣品的胞質(zhì)內(nèi)均有明顯的特異性綠色熒光，細(xì)胞核未被染色呈現(xiàn)灰暗色；而MDV和ALV均為陰性。分離到的REV命名為WFSG1301和WFSG 1302。

2.2 REV分離株env基因的克隆測序與序列分析

以WFSG1301和WFSG1302感染后細(xì)胞總DNA為模板，用PCR均擴(kuò)增出了約2kb左右的清晰條帶，與預(yù)期目的片段相符；陰性對(duì)照未擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶。對(duì)2個(gè)陽性樣品的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明，WFSG1301和WFSG1302兩個(gè)毒株的env基因全長均為1761bp，編碼587個(gè)氨基酸，2株REV之間env基因的核酸同源性為99.8%，氨基酸同源性為99.7%；與7株不同參考株序列比較顯示W(wǎng)FSG1301和WFSG1302與分離自中國黑龍江的HLJR0901和分離自中國臺(tái)灣的Chicken/3337/05親緣關(guān)系最近(圖1、圖2)，處于進(jìn)化樹上同一分支。

圖1 分離REV與參考毒株env氨基酸同源性

圖2 以env基因WFSG1301和WFSG1302與不同REV參考毒株的進(jìn)化關(guān)系

3 討論

REV既可水平傳播又可以垂直傳播，但主要以垂直傳播為主。垂直傳播發(fā)生在輸卵管內(nèi)蛋形成過程中蛋清的污染，因而雛雞孵出后已經(jīng)受到了REV病毒的感染。有證據(jù)表明，早期的水平傳播發(fā)生得相當(dāng)迅速，發(fā)病雞血液中循環(huán)病毒在孵化后3～6周能增加10次方倍。此外，在禽用弱毒活疫苗中污染REV引起的REV爆發(fā)案例也時(shí)有報(bào)道，如雞痘病毒疫苗[6].

由于REV病毒的宿主范圍和傳播途徑特點(diǎn)使得REV迅速傳播到世界各地，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。近年來，我國雞群中REV的血清抗體陽性率逐漸增高，特別是在地方品系雞中尤為嚴(yán)重[2,3]，并且REV與其它雞免疫抑制性病毒的混合感染也比較普遍[7-9]。本研究即從山東省地方品系壽光雞中分離到定了2株REV，顯示地方品系雞中REV仍然是不容忽視的問題之一。

REV基因組為正義的單鏈RNA，編碼gag、pol和env等3種蛋白，其中env蛋白是囊膜蛋白，能被進(jìn)一步裂解為表面蛋白(gp90)和穿膜蛋白(gp20)[10]，在三種蛋白中相對(duì)變異較快。對(duì)本研究分離的2株REV進(jìn)行env基因序列的測定和分析顯示，WFSG1301和WFSG1302與分離自鴨源的SNV株和10年前分離自中國南方的毒株HA9901株同源性較低處于2個(gè)分枝，而與分離自東北地區(qū)的毒株HLJR0901和中國臺(tái)灣雞源毒株Chicken/3337/05處于一個(gè)分枝，表明他們可能有共同的來源。

本試驗(yàn)分離到的2株REV的env基因同源性為99.8%但并非完全同源，顯示即使在同一雞群同時(shí)感染的REV 毒株也存在一定的差異，推測這與反轉(zhuǎn)錄病毒的高度異變和準(zhǔn)種有關(guān)。病毒的準(zhǔn)種多樣性與其基因的復(fù)制關(guān)系密切，已有的研究顯示H9N2 亞型禽流感病毒每個(gè)復(fù)制周期中HA 基因每個(gè)核苷酸的突變幾率為2×10-3，也就是說病毒每復(fù)制一代，HA 基因上大約有一個(gè)堿基發(fā)生變異[11]。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)上特別是在同一個(gè)動(dòng)物體內(nèi)，被稱為一種病毒的群體實(shí)際上是在基因組上各有差異的準(zhǔn)種的群體，本研究結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了REV準(zhǔn)種的復(fù)雜性。

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