劉恩順 劉 偉 孫增濤 蘇景深 關(guān) 鵬

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科，天津，300150）

實(shí)驗(yàn)研究

清肺消炎丸對(duì)COPD大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響

劉恩順 劉 偉 孫增濤 蘇景深 關(guān) 鵬

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科，天津，300150）

目的：觀察清肺消炎丸對(duì)COPD大鼠肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP -1）表達(dá)的影響。方法：將30只Wistar大鼠，隨機(jī)分為3組，正常對(duì)照組、COPD模型組和清肺消炎丸組，除正常對(duì)照組外，采用煙熏及內(nèi)窺鏡下氣管滴入內(nèi)毒素方法制作COPD模型，造模成功后分別治療7 d，觀察各組肺組織中MMP-9和TIMP-1表達(dá)變化。結(jié)果：模型組大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1的表達(dá)與空白組相比明顯增強(qiáng)（P＜0.05），中藥治療組大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1水平比模型組減低（P＜0.05）。結(jié)論：清肺消炎丸具有抑制COPD大鼠肺組織中MMP-9及TIMP-1的表達(dá)，改善MMP-9／TIMP-1比例失衡，從而防治該病氣道重塑的作用。

清肺消炎丸；慢性阻塞性肺疾??；急性發(fā)作期；MMP-9；TIMP-1

慢性阻塞性肺部疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）的病理以肺泡壁進(jìn)行性破壞，肺泡擴(kuò)張為其特征性改變。大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，蛋白酶／抗蛋白酶的失衡是其主要原因之一。近年來基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP-1）失衡漸漸受到重視。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察清肺消炎丸治療對(duì)COPD大鼠肺組織中MMP-9、TIMP -1表達(dá)的影響，探討其干預(yù)COPD大鼠氣道重構(gòu)的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康Wistar大鼠30只，雄性，體重250～300 g，天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥物 清肺消炎丸由天津中新藥業(yè)達(dá)仁堂制藥廠生產(chǎn)。

1.1.3 試劑及儀器 內(nèi)毒素（美國Sigma公司），大前門牌過濾嘴香煙（上海卷煙廠生產(chǎn)），兔抗鼠MMP-9和TIMP-1及SABC免疫染色試劑盒、DAB顯色試劑盒（棕黃色），均為武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。OLYMPUS CX—31顯微鏡為日本OLYMPUS光學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。JVC數(shù)碼相機(jī)為日本JVC公司生產(chǎn)。HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)由武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 COPD模型的建立 采用煙熏及內(nèi)窺鏡下氣管滴入內(nèi)毒素造模法制造COPD大鼠模型［1］。除正常對(duì)照組呼吸正?？諝馔?，其他各組大鼠每天上午在自制的密閉箱內(nèi)熏大前門牌香煙霧0.5 h。在實(shí)驗(yàn)開始第1 d和第14 d時(shí)，各組大鼠均用乙醚麻醉，除正常對(duì)照組在硬式鼻腔鏡引導(dǎo)下經(jīng)聲門緩慢滴入200 μL生理鹽水外，200 μL內(nèi)毒素水溶液（1 mg／mL），當(dāng)日不予被動(dòng)吸煙。連續(xù)熏煙4周后，造成慢性阻塞性肺疾病模型。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將Wistaer大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。（1正常對(duì)照組：灌服生理鹽水1 mL／100g，1次／d，灌服7 d；（2模型對(duì)照組：灌服生理鹽水1 mL／100 g，1次／d，灌服7 d；（3清肺消炎丸組：每天灌服量1 mL／100 g，以含清肺消炎丸量為：1.56 g／kg，1次／d，灌服7 d。3組均在停止煙熏的第2 d開始灌藥。

1.2.3 石蠟切片與免疫組化 灌藥結(jié)束后的第2 d，10%水合氯醛腹腔麻醉后，取出肺組織并置于福爾馬林溶液中常規(guī)固定后，各大鼠肺組織行常規(guī)石蠟切片，片厚5 μm。各切片脫蠟至水，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶法（武漢博士德公司，SP即用型試劑盒）在石蠟切片上測MMP-9和TIMP-1的免疫組化表達(dá)，一抗為1∶100 MMP-9和TIMP-1多克隆抗體，二抗為生物素山羊抗兔IgG，陰性對(duì)照標(biāo)本除以PBS代替一抗外，其他步驟與被測標(biāo)本相同，DAB室溫顯色，陽性反應(yīng)為胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒。

1.2.4 照相及圖像分析 每只大鼠的免疫組化標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野；400倍光鏡下進(jìn)行觀察。用JVC數(shù)碼相機(jī)在400倍下照相，用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)對(duì)各切片在400倍下進(jìn)行圖像分析，每張切片的周圍隨機(jī)選擇5個(gè)計(jì)算機(jī)視野，測定各組有MMP-9和TIMP-1陽性反應(yīng)物質(zhì)的光密度，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。平均光密度反應(yīng)某物質(zhì)吸收光的程度，被測結(jié)構(gòu)顏色越深，平均光密度值則越大。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的檢測結(jié)果 MMP-9在正常對(duì)照組，肺組織中僅見微量的表達(dá)，在模型組肺組織中可見到強(qiáng)陽性表達(dá)。模型組肺組織中的表達(dá)明顯強(qiáng)于正常對(duì)照組，但清肺消炎丸組明顯弱于模型組，見圖1。

2.2 大鼠肺組織金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP -1）檢測結(jié)果 TIMP-1在正常對(duì)照組肺組織中僅見微量的表達(dá)，在模型組的肺組織中可見到強(qiáng)陽性表達(dá)。模型組肺組織中的表達(dá)明顯強(qiáng)于正常對(duì)照組，但清肺消炎丸組明顯弱于模型組，見圖2。

圖1 3組大鼠肺組織中MMP-9表達(dá)情況

圖2 3組大鼠肺組織中TIMP-1表達(dá)情況

2.3 3組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1陽性細(xì)胞的平均吸光度值比較，見圖3。

圖3 大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1陽性細(xì)胞科均吸光度值

3 討論

由于遺傳因素或炎癥細(xì)胞和遞質(zhì)的作用，肺內(nèi)源性蛋白酶和抗蛋白酶失衡，構(gòu)成肺泡壁的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）受損是肺氣腫性破壞的主要機(jī)制［2-4］。正常情況下構(gòu)成肺泡壁的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）處于合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡，蛋白酶分泌增加和／或抗蛋白酶合成減少均可致細(xì)胞外基質(zhì)受損。MMP-9和TIMP-1的動(dòng)態(tài)平衡，目前被認(rèn)為是反映氣道組織破壞與修復(fù)動(dòng)態(tài)平衡的標(biāo)志［5-7］。COPD患者由于炎癥刺激促使的炎性細(xì)胞的增加，產(chǎn)生蛋白酶增加，活性增強(qiáng)，當(dāng)超過抗蛋白酶的數(shù)量及活性時(shí)，引起彈性纖維的破壞，促使了肺氣腫的形成［8］。

基質(zhì)金屬蛋白酶類（MMPs）是一組由鈣離子激活的含鋅離子的內(nèi)肽酶家族，幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成份，其主要由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等合成與分泌。在炎癥、創(chuàng)口愈合、腫瘤浸潤等疾病過程中有重要作用［9-12］。MMP-9即明膠酶B，其主要作用為降解彈力纖維、明膠、及Ⅳ、V型膠原。其參與COPD的發(fā)病機(jī)制主要是通過破壞肺泡基質(zhì)成分，使肺泡結(jié)構(gòu)破壞，形成肺氣腫及參與氣道重塑而導(dǎo)致氣流阻塞［13］。Kang等［14］報(bào)道，肺實(shí)質(zhì)MMP-9的表達(dá)與吸煙有明顯的相關(guān)性，并且其表達(dá)水平與FEV1呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)COPD模型組大鼠肺組織中MMP-9的表達(dá)明顯增強(qiáng)，證實(shí)了其參與了COPD的發(fā)生和發(fā)展。

TIMPs是MMPs的內(nèi)源性天然抑制因子，廣泛分布于組織和體液中，其主要作用為促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積和抑制其降解，并類似生長因子可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞、表皮細(xì)胞等增生。TIMP-1是所有亞類中活性最強(qiáng)的，其特異性抑制MMP-9活性，能被多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生［14-15］。Vegnol等［16］在患者痰中發(fā)現(xiàn)MMP-9和TIMP-1含量顯著高于健康人，MMP-9／TIMP-1則低于正常人，且這一比值與第1秒用力呼氣容積呈正相關(guān)，表明MMP-9／TIMP-1失衡是引起COPD的一個(gè)重要機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示COPD模型組大鼠肺組織中TIMP-1的蛋白表達(dá)也明顯增強(qiáng)，其可能是由于病理因素刺激下MMP-9增多，使降解細(xì)胞外基質(zhì)增多，從而做出的反饋的應(yīng)答，以避免組織破壞過度。

我們在多年的臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)COPD急性發(fā)作期患者，以“痰熱郁肺”之證多見，故擬用“清熱宣肺平喘”法，以達(dá)到“清痰熱、宣肺氣、平氣喘”的作用。清肺消炎丸由《傷寒論》中的麻杏石甘湯為基礎(chǔ)化裁而來，主要藥物包括：麻黃，石膏，杏仁，地龍，牛蒡子，葶藶子，牛黃，羚羊角等。方中麻黃宣肺平喘，被譽(yù)為“治喘圣藥”；石膏，牛黃，羚羊角清熱化痰，其中石膏配麻黃，清宣肺中郁熱而起到平喘之功效；杏仁，牛蒡子宣降肺氣，協(xié)同麻黃以治咳喘；地龍平喘通絡(luò)，諸藥合用，功效將至。

基于本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果我們認(rèn)為：在慢性阻塞性肺部疾急性發(fā)作期，以TIMP-1相對(duì)增高而導(dǎo)致MMP-9／TIMP-1失衡為特征，進(jìn)而引起以反饋性的細(xì)胞外基質(zhì)沉積和氣道重塑為主的病理變化可能是該病發(fā)展過程中的重要階段，也是影響疾病轉(zhuǎn)歸的重要因素之一。在清熱宣肺平喘法指導(dǎo)下運(yùn)用清肺消炎丸進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)清肺消炎丸治療后大鼠MMP-9和TIMP-1的表達(dá)均明顯下降，且以抑制TIMP-1的表達(dá)更為顯著。提示通過對(duì)MMP-9和TIMP-1的抑制，從而使肺臟基質(zhì)的降解減少，同時(shí)可以防止肺泡外基質(zhì)過度增生，減輕氣道重塑，可能是該治法指導(dǎo)下用藥干預(yù)COPD的作用機(jī)制之一。

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（2013-01-03收稿）

Effect of Qingfei Xiaoyan Pills on the Expression of MMP-9 and TIMP-1 in the Lung Tissue of COPD Rats

Liu Enshun，Liu Wei，Sun Zengtao，Su Jingshen，Guan Peng
（The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjn 300150，China）

Objective：To observe the effect of Qingfei Xiaoyan Pills on the expression of matrix metalloproteinase-9（MMP-9）and tissue inhibitor of metalloproteinase-1（TIMP-1）in the lung tissue of COPD Rats.Methods：Thirty Wistar rats were divided into 3 groups randomly，normal control group，COPD model group，Qingfei Xiaoyan Pills group.Except for the normal control group，we made the COPD model by smudging plus intratracheal instillation of LPS under endoscopy，and treated them separately for 7days.Then we observed the change of MMP-9 and TIMP-1 expression in the lung tissue.Results：The MMP-9and TIMP-1 expression in the lung of COPD model group were obviously increased than those of control group（P＜0.05），the MMP-9 and TIMP-1 of Qingfei Xiaoyan Pills group were lower than those of model group（P＜0.05）.Conclusion：Qingfei Xiaoyan Pills could inhibit the expression of MMP-9 and TIMP-1 in the lung in COPD rats，improve the MMP-9／TIMP-1 imbalance，thus playing a role in preventing and treating airway remodeling in COPD.

Qingfei Xiaoyan Pills；COPD；Acute exacerbation；MMP-9；TIMP-1

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.06.021