韓貴和 魏 威 顧 軍 汪翼凡 應(yīng)小樟 杭州市紅十字會醫(yī)院骨科 杭州310003

·論 著·

Bcl-2基因抑制神經(jīng)細胞凋亡的實驗研究

韓貴和 魏 威 顧 軍 汪翼凡 應(yīng)小樟 杭州市紅十字會醫(yī)院骨科 杭州310003

目的：觀察原癌基因bcl-2對神經(jīng)細胞凋亡的抑制作用。方法：培養(yǎng)PC12細胞至對數(shù)生長期，用100感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）的攜帶bcl-2基因的慢病毒質(zhì)粒及未攜帶bcl-2基因的慢病毒質(zhì)粒感染PC12細胞。再將其分為A、B、C、D四組，A組為攜帶bcl-2基因慢病毒質(zhì)粒的PC12細胞（bcl-2-PC12細胞），B組為未攜帶bcl-2基因慢病毒質(zhì)粒PC12細胞（NC-PC12細胞），C組為bcl-2慢病毒質(zhì)粒PC12細胞加H2O2（bcl-2-PC12細胞+H2O2），D組為NC慢病毒質(zhì)粒PC12細胞加H2O2（NC-PC12細胞+H2O2）。應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，采用BCA（bicinchoninic acid）法檢測bcl-2基因表達蛋白。結(jié)果：A組細胞凋亡率低于B組（P＜0.05），C組細胞凋亡率低于D組（P＜0.05）；A組bcl-2基因蛋白濃度高于B組（P＜0.05），C組bcl-2基因蛋白濃度高于D組（P＜0.05）。結(jié)論：bcl-2基因?qū)φＩ窠?jīng)細胞的凋亡有抑制作用，能夠增強神經(jīng)細胞的抗損傷能力。

bcl-2基因 神經(jīng)細胞 凋亡

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）可導致嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，如截癱和四肢癱。目前尚無一種方法能使SCI患者的神經(jīng)功能得以明顯恢復(fù)?；蛑委煟╣ene therapy）是當前生物醫(yī)學研究迅猛發(fā)展的領(lǐng)域之一［1-2］，有望改善SCI患者的神經(jīng)功能。自1997年Chen等發(fā)現(xiàn)原癌基因bcl-2能促進哺乳動物切斷的中樞神經(jīng)軸突的再生后，眾多學者對bcl-2基因的作用進行了探索，并且取得了令人矚目的研究進展［3-4］。PC12細胞是從大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆的神經(jīng)細胞株，常用于實驗研究。本研究對bcl-2基因抑制PC12細胞凋亡及增強其抗損傷的作用做了一些探索，獲得了滿意的結(jié)果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、H2O2（無錫市晶科化工有限公司）、胎牛血清（FBS，蘭州民海生物有限公司）、馬血清（HS，美國Hyclone公司）、胰蛋白酶（美國Gibco公司）、Alexa Flour 488 annexin V∕Dead Cell Apoptosis Kit（美國Invitrogen公司）。

1.2 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（3111型，美國Thermo公司）、倒置熒光顯微鏡（DMIL型，德國Leica公司）、臺式離心機（上海醫(yī)療器械有限公司）、流式細胞儀（美國BD公司）、電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.3 PC12細胞和慢病毒質(zhì)粒 PC12細胞（購于中科院上海細胞庫）、攜帶bcl-2基因的慢病毒質(zhì)粒（bcl-2慢病毒質(zhì)粒，購于上海吉瑪生物公司）、不攜帶bcl-2基因的慢病毒質(zhì)粒（NC慢病毒質(zhì)粒，購于上海吉瑪生物公司）。

1.4 細胞培養(yǎng) 從液氮罐復(fù)蘇PC12細胞，10%FBS+ 5%HS，1×青-鏈霉素DMEM培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，傳代2～3次使細胞完全恢復(fù)。

1.5 慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期PC12細胞胰酶消化，1 200r∕min離心5min，收集細胞，以DMEM完全培養(yǎng)基輕輕吹打混勻細胞，細胞計數(shù)，以1×105∕孔細胞量鋪布6孔培養(yǎng)板，待細胞完全貼壁后細胞匯合度50%左右，換新鮮培養(yǎng)基準備轉(zhuǎn)染。用100感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）病毒感染PC12細胞。

1.6 H2O2損傷細胞 將轉(zhuǎn)染bcl-2慢病毒質(zhì)粒的PC12細胞及轉(zhuǎn)染NC慢病毒質(zhì)粒的PC12細胞，取對數(shù)生長期細胞胰酶消化，細胞計數(shù)，以1×105∕孔細胞量鋪布6孔培養(yǎng)板，各組細胞棄舊培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，換上無血清DMEM孵育24h使細胞同步化。棄舊培養(yǎng)液，PBS液清洗2次。將上述兩種細胞分為A、B、C、D四組，即A組為單純bcl-2慢病毒質(zhì)粒PC12細胞（bcl-2-PC12細胞），B組為單純NC慢病毒質(zhì)粒PC12細胞（NC-PC12細胞），C組為bcl-2慢病毒質(zhì)粒PC12細胞加H2O2（bcl-2-PC12細胞+ H2O2），D組為NC慢病毒質(zhì)粒PC12細胞加H2O2（NC-PC12細胞+H2O2）。C、D組細胞以1mmol∕LH2O2作用1h對其進行損傷。

1.7 PI染色流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 胰酶消化上述細胞，1 200r∕min離心5min，收集細胞，用4℃PBS液洗滌2次，加入100μL1Xannexin-binding buffer溶解，按照凋亡檢測試劑盒操作，依次加入5μLAnnexin V和1μL100μg∕m lPI，孵育15min，再加入400μL1Xannexin-binding buffer后上機檢測。

1.8 Western blot法檢測bcl-2基因表達蛋白

1.8.1 蛋白樣品制備 吸取細胞培養(yǎng)液1mL，備用。每瓶細胞加2mL 4℃的PBS，輕輕搖動1min洗滌細胞，然后棄去洗液。用胰酶消化貼壁細胞，并收集至備用的4℃細胞培養(yǎng)液中。1 200r∕min離心5min，收集細胞，小心吸除上清液。PBS洗滌1次，吸除上清液后加1mLPBS重懸，將細胞轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，1200r∕min離心5min，收集細胞。按1mL裂解液加10μL PMSF（100mM），混合均勻。每瓶細胞加100μL含PMSF的裂解液，在4℃下裂解30min，為使細胞充分裂解，EP管要經(jīng)常搖動。裂解完畢，于4℃、12 000r∕min離心10min。將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，于-70℃條件下保存。

1.8.2 BCA（bicinchoninic acid）法測定蛋白濃度將0.5mg∕mL標準牛血清蛋白按0、1、2、4、8、12、16、20μL分別加到96孔板的標準品孔中，加標準品稀釋液補足到20μL。樣品用標準品稀釋液稀釋一定濃度后加20μL到96孔板中。按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50:1）配制適量BCA工作液，充分混勻，各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置30min。測定562nm處的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣品的蛋白濃度。

1.9 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，先做正態(tài)性分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示。細胞凋亡的分布符合二項分布，故細胞凋亡率的比較采用U檢驗。蛋白濃度服從正態(tài)分布，進行F檢驗，成組資料t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 bcl-2基因?qū)C12細胞凋亡率的影響 A組細胞凋亡率8.11%較B組15.63%低（U=2.16，P＜0.05），C組細胞凋亡率12.27%較D組26.38%低（U=2.38，P＜0.05）。說明bcl-2基因可抑制PC12細胞的凋亡，增強PC12細胞的抗損傷能力，見圖1。

圖1 細胞凋亡率圖示

2.2 bcl-2基因?qū)C12細胞表達蛋白的影響 A組bcl-2基因表達蛋白濃度高于B組（t=2.87，P＜0.05），說明A組存活細胞數(shù)多，bcl-2基因表達蛋白濃度高，bcl-2基因具有抗凋亡作用。C組bcl-2基因表達蛋白濃度高于D組（t=2.87，P＜0.05）。說明在細胞受到損傷時，bcl-2基因表達蛋白濃度高的細胞，抗損傷能力強，證明bcl-2基因具有增強神經(jīng)細胞的抗損傷作用。見表1。

表1 bcl-2蛋白濃度（） μg∕L

表1 bcl-2蛋白濃度（） μg∕L

注：與D組比較，△P＜0.05

組別A組B組C組D組n 10 10 10 10蛋白濃度0.56±0.02 0.46±0.02 0.32±0.02△0.18±0.02

3 討 論

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）可導致嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙如截癱和四肢癱。SCI造成的影響比較廣泛，可影響到運動、呼吸、消化、泌尿和生殖系統(tǒng)等多個器官的正常功能。目前，國內(nèi)外在脊髓損傷的綜合治療方面主要采取以下兩個策略：①在急性期使用神經(jīng)保護劑，以阻止損傷的進一步發(fā)展。這種療法包括提高氧合能力、清除自由基及各種生化紊亂。②在亞急性期和后期使用神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophic factors，NTF）以防止神經(jīng)元營養(yǎng)匱乏并促進軸突生長，也可聯(lián)用神經(jīng)元移植和遺傳工程細胞導入的方法；同時采用與髓鞘形成有關(guān)的抑制蛋白抗體來促進軸突的長距離再生能力。遺憾的是，目前尚無一種方法能使SCI患者的功能得以明顯恢復(fù)。

基因治療（gene therapy）是指將限定的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入患者特定的靶細胞，以最終達到預(yù)防或改變特殊疾病狀態(tài)為目的的治療方法。原癌基因Bcl-2是一種與細胞凋亡密切相關(guān)的癌基因。1997年Chen等發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因能促進切斷的哺乳動物中樞神經(jīng)軸突的再生，第一次為脊髓損傷后的神經(jīng)元再生提供了理論依據(jù)［5］。Takahashi等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓損傷后注射攜帶Bcl-2基因的DNA質(zhì)粒能減少神經(jīng)元的凋亡。Shimazaki等［7］利用腺伴隨病毒載體轉(zhuǎn)導Bcl-2基因至中樞神經(jīng)系統(tǒng)進行表達，證實了轉(zhuǎn)導基因治療中樞神經(jīng)損傷—腦缺血再灌注損傷的可能性。已有大量文獻［8-10］表明，無論體內(nèi)還是體外，bcl-2基因?qū)τ趽p傷導致的神經(jīng)細胞凋亡有明顯的保護作用。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染攜帶bcl-2慢病毒的PC-12細胞組（A組）凋亡率低于未攜帶bcl-2慢病毒的PC-12細胞組（B組）（P＜0.05）。bcl-2基因表達蛋白濃度測定顯示，A組高于B組（P＜0.05），說明bcl-2基因?qū)φC12細胞的凋亡有抑制作用，能延長PC12細胞的壽命。C組（bcl-2-PC12+H2O2）細胞凋亡率低于D組（NC-PC12+H2O2）（P＜0.05），bcl-2基因表達蛋白濃度高于D組（P＜0.05），證明bcl-2基因能夠增強PC12細胞的抗損傷能力。盡管有大量的研究證明bcl-2基因有抗細胞凋亡作用，能夠增強細胞對抗損傷的能力，但bcl-2基因轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)，有可能導致細胞無限制生長，使機體罹患癌癥。

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Inhibiting Role of Bcl-2 Gene in the Apoptosis of Nerve Cells

HAN Guihe，WEIWei，GU Jun，et al. Hangzhou Red Cross Hospital，Hangzhou(310003)，China

Objective:To observe the inhibiting role of the proto-oncogene bcl-2 in the apoptosis of nerve cells. M ethods:PC12 cells were cultured to the logarithmic growth phase and then slow virus plasmid carrying the bcl-2 gene and slow virus plasmid infected PC12 cells by 100 multiplicity of infection,respectively.The PC12 cells infected were then divided into 4 groups.Group A：PC12 cells with slow virus plasmid carrying the bcl-2 gene；group B：PC12 cells with slow virus plasmid；group C：PC12 cells with slow virus plasmid carrying the bcl-2 gene，which were damaged by H2O2；group D：PC12 cells with slow virus plasmid，which were damaged by H2O2.The rate of apoptosis was detected by flow cytometry.The proteinum concentration of bcl-2 gene expression was detected by using bicinchoninic acid method.Results:The apoptosis rate of group A was lower than that of group B and the protein concentration of bcl-2 gene expression of group A was higher than that of group B，both of which were significantly different between the 2 groups（P＜0.05）.The apoptosis rate of group C was lower than that of group D and the protein concentration of bcl-2 gene expression of group C was higher than that of group D，both of which significantly differed between the 2 groups（P＜0.05）.Conclusion:Bcl-2 gene can inhibit apoptosis of normal nerve cells and can enhance resistance ability of nerve cell to be damaged.

bcl-2 gene nerve cells apoptosis

2012-11-19

杭州市科技發(fā)展計劃（No.20100733Q22）