賈 寧，王 平，陸 紅，郭妍妍，楊超群，鄭小奇，尹燕博＊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.青島澳蘭百特生物工程有限公司，山東青島 266101；3.青島市畜牧局，山東青島 266000；4.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

山東部分地區(qū)雞源致病性大腸埃希菌優(yōu)勢血清型篩選及致病力試驗

賈 寧1，王 平2，陸 紅3，郭妍妍2，楊超群2，鄭小奇4，尹燕博1＊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.青島澳蘭百特生物工程有限公司，山東青島 266101；3.青島市畜牧局，山東青島 266000；4.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

收集山東省部分地區(qū)養(yǎng)雞場送檢病料，對該區(qū)域雞致病性大腸埃希菌的血清型分布、致病力情況進(jìn)行了研究。在送檢的108份病料中分離到80株大腸埃希菌，分離率為74.0%。通過血清型鑒定試驗，定型O抗原共74株，分為9個血清型，即O2、O78、O157、O35、O103、O6、O18、O178和O55。其中優(yōu)勢血清型為 O2型23.0%（17／74）、O35型20.2%（15／74）、O78型17.6%（13／74）3種，占定型菌株的61.2%，占待檢菌株的56.2%。說明山東地區(qū)雞大腸埃希菌血清型分布具有復(fù)雜性的特點(diǎn)。

雞大腸埃希菌；致病力；血清型

禽大腸桿菌病是由致病性大腸埃希菌引起的一種傳染病，剖檢病變主要包括肝周炎、纖維素性心包炎、臍炎、敗血癥、腹膜炎、氣囊炎等［1－3］。隨著肉雞養(yǎng)殖業(yè)呈上升態(tài)勢，肉仔雞大腸桿菌病流行勢頭近幾年迅速抬頭，給相關(guān)養(yǎng)殖場造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。本試驗對山東部分地區(qū)的禽大腸桿菌病進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查、強(qiáng)致病菌株篩選，目的在于查清本地區(qū)的主要流行菌株，為疫苗研制和防治本病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

待檢菌株于2011年－2012年間青島澳蘭百特生物工程有限公司診斷中心送檢病料中分離得到。標(biāo)準(zhǔn)O型單因子血清購于中國獸藥監(jiān)察所。動物試驗所用肉仔雞購于萊西某養(yǎng)殖場。試劑均為青島澳蘭百特生物工程有限公司診斷中心提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無菌采集病雞、瀕死雞的肝臟、心血劃線接種于麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍(lán)平板、營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18h～20h。同時進(jìn)行涂片、革蘭染色，觀察細(xì)菌形態(tài)特點(diǎn)。

1.2.2 生化試驗 選取上述分離出的典型菌落純培養(yǎng)后，按常規(guī)方法［4－5］對所有分離株進(jìn)行三糖鐵試驗（TSI）、葡萄糖、乳糖、麥芽糖等糖發(fā)酵試驗、吲哚試驗、MR試驗、VP試驗、枸櫞酸鹽試驗、脲酶試驗。

1.2.3 O抗原的制備及血清型鑒定 已純培養(yǎng)的菌株劃線接種在營養(yǎng)瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)18h～20h。用5g／L石炭酸生理鹽水2mL洗脫菌苔，制成濃稠菌懸液，121℃高壓2h，破壞其K、H抗原，得到O抗原。通過玻板凝集試驗，用標(biāo)準(zhǔn)O型分型血清，對所分離的菌株進(jìn)行血清型鑒定。經(jīng)0～5min（或適當(dāng)延長反應(yīng)時間）出現(xiàn)凝集者判為陽性，以“＋”表示；同時以高壓抗原與5g／L石炭酸生理鹽水混合作對照，觀察有無自凝現(xiàn)象。

1.2.4 致病力試驗及不同血清型間病理變化觀察

將14日齡健康雛雞110只，隨機(jī)分成11組，每組10只。取經(jīng)血清型鑒定的前3種優(yōu)勢血清型各3株，分別接種于普通營養(yǎng)肉湯中，恒溫振蕩培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)12h～15h。肉湯培養(yǎng)物離心，去上清，生理鹽水重懸（每毫升含菌量約109cfu），0.5mL進(jìn)行腿 肌 注 射［6］。1 組 肌 注 無 菌 生 理 鹽 水 （0.5 mL／只），作陰性對照組。1組肌注O2型標(biāo)準(zhǔn)毒株（0.5mL／只），作陽性對照組。各組在相同環(huán)境隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察1周，記錄其發(fā)病、死亡數(shù)和不同血清型間剖檢病變情況。

1周后撲殺存活雞，將試驗中有明顯病變的肝臟、心血作為病料，進(jìn)行感染菌的分離回收檢驗。致病力判定標(biāo)準(zhǔn)：攻毒后，能使雞在24h內(nèi)全部死亡或在48h內(nèi)死亡2／3以上的菌株作為致病菌株。

2 結(jié)果

2.1 待檢菌株的分離與理化特性

待檢菌株在普通營養(yǎng)瓊脂平板上形成半透明，中等大小，圓形光滑隆起，邊緣整齊的菌落；在麥康凱瓊脂平板上形成圓形、光滑、隆起、濕潤、紅色的菌落；在伊紅美藍(lán)平板上形成金屬光澤的黑色菌落。通過革蘭染色鏡檢發(fā)現(xiàn)有革蘭染色陰性、中等大小、散在的、兩端鈍圓的桿菌。

2.2 生化試驗結(jié)果

對分離到的80株菌進(jìn)行了常規(guī)生化試驗［7］，結(jié)果符合大腸埃希菌的特征。分離菌均能發(fā)酵多種碳水化合物（含葡萄糖），發(fā)酵乳糖遲緩，36株菌能發(fā)酵蔗糖；吲哚、MR試驗陽性；VP試驗陰性；均不能分解尿素。

2.3 血清學(xué)鑒定結(jié)果

利用玻板凝集反應(yīng)法，對所分離到的80株大腸埃希菌進(jìn)行血清學(xué)鑒定。74株能夠定型，占被檢菌株的92.5%，屬于9種不同的O血清群；未鑒定出的6株，占被檢菌株的7.5%（表1）。從表1可以看出，定型菌 株 所 占 比 例 為 O2（23.0%）、O35（20.4% ）、O78（17.8%）、O157（10.8%）、O6（8.0%）、O178（7.0%）、O18（5.0%）、O103（4.0%）和O55（4.0%）。由高到低選取3種，故優(yōu)勢血清型為O2、O35、O78。

表1 大腸埃希菌血清型鑒定結(jié)果（n＝74）Table 1 Results of Escherichiacoli serotype identification（n＝74）

2.4 致病力試驗結(jié)果

圖1 病死雞心包積液Fig.1 Pericardial effusion of sick chicken

圖2 病死雞心包炎，肝出血Fig.2 Fibrinous pericarditis and Liver hemorrhage in sick chicken

圖3 病死雞心臟表面覆蓋纖維素性滲出物Fig.3 Fibrinous exudate on the surface of heart in sick chicken

攻毒12h后各組雞均表現(xiàn)精神沉郁，飲食欲下降或廢絕。死亡高峰在接種后24h～48h。主要病變?yōu)樾陌e液，呈半渾濁狀（圖1），內(nèi)臟充血出血、肝臟可見大小不一的出血點(diǎn)（圖2），排出灰白色或黃綠色帶血稀糞。接種48h后死亡雞剖檢表現(xiàn)為纖維素性心包炎（圖3）、肝周炎（圖4）。從死亡雞或產(chǎn)生嚴(yán)重病變雞體內(nèi)均能分離到接種菌。對照組雞全部健活，7d中未發(fā)現(xiàn)眼觀病變、未分離到大腸埃希菌。

圖4 病死雞肝實質(zhì)剝離纖維素性膜Fig.4 Fibrinous pseudomembranes in the liver of sick chicken

3種優(yōu)勢血清型O2、O78、O35致病性試驗結(jié)果見表2。結(jié)果表明，9株菌中 O2-2、O78-1、O35-1為高致病菌株。

由表3可見，O2-1組主要病變?yōu)槔w維素性心包炎，O2-2組主要病變?yōu)樾陌e液，O2-3組主要病變?yōu)楦沃苎?；O35-1組主要病變?yōu)樾陌e液，O35-2組主要病變?yōu)樾陌e液，O35-3組主要病變?yōu)槔w維素性心包炎；O78-1組主要病變?yōu)楦沃苎祝琌78-2組主要病變?yōu)樾陌e液，O78-3組主要病變?yōu)槔w維素性心包炎。這表明同一血清型的不同菌株可以有不同的臨床剖檢病變，不同血清型菌株間剖檢病變也具有一定的差異性，說明菌株的血清型與致病性并無明顯相關(guān)性。

表2 優(yōu)勢菌株動物致病性試驗結(jié)果Table 2 The pathogenic in results of predominant strains experimental chickens

表3 不同血清型間病理變化觀察結(jié)果Table 3 Observation results of pathological lesions by different serotypes

3 討論

本試驗從山東地區(qū)病、死雞中分離到80株細(xì)菌，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)檢查、生化鑒定和血清學(xué)試驗證實后，表明分離菌為雞致病性大腸埃希菌。從80株大腸埃希菌中鑒定出O2、O78、O35、O157、O103、O6、O18、O178和O55九種血清型，其中O2、O35、O78三型分別占被檢菌株的23.0%、20.4%、17.8%，為該地區(qū)的雞大腸埃希菌優(yōu)勢血清型。隨后選用優(yōu)勢血清型菌株對商品肉仔雞進(jìn)行人工感染試驗，篩選出3株高致病性菌株。通過雞致病性大腸埃希菌血清型與病理變化之間的相關(guān)性分析，表明菌株的血清型與其臨床病變無明顯相關(guān)性。

隨著畜牧業(yè)的現(xiàn)代化、集約化和規(guī)?；a(chǎn)，目前多數(shù)養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理過程中濫用抗生素現(xiàn)象普遍存在［8］，更有甚者，將獸藥用作飼料添加劑來降低動物發(fā)病率與死亡率、提高飼料利用率、促進(jìn)生長和改善產(chǎn)品品質(zhì)。這都將導(dǎo)致畜產(chǎn)品獸藥殘留［9］，人攝入后嚴(yán)重危害健康；而養(yǎng)殖動物所產(chǎn)生的包括糞便、尿等在內(nèi)的排泄物，如未加處理就排放于周圍環(huán)境中，獸藥殘留又會成為環(huán)境污染物，給自然生態(tài)環(huán)境帶來不利影響。在這種惡劣的環(huán)境和態(tài)勢之下，大腸埃希菌的耐藥性愈加嚴(yán)重［10］，養(yǎng)雞業(yè)的藥物治療成本不斷加大，而療效卻越來越差。因此，研發(fā)出針對本地區(qū)使用的大腸埃希菌疫苗迫在眉睫。采用疫苗免疫不僅能有效遏制大腸桿菌病的廣泛流行［11］，還可以有效控制雞肉中的藥物殘留，使其更符合綠色食品要求。本試驗從山東部分雞場發(fā)病雞分離篩選的3株高致病性大腸埃希菌菌株具有良好的代表性和普遍性，這些都為疫苗的研制打下了良好的基礎(chǔ)。

據(jù)相關(guān)資料記載和報道，禽源大腸埃希菌的血清型眾多。目前國外報道的血清型已達(dá)160多種［12－13］，其中能引起雞發(fā)病的大腸埃希菌型別有50多種。常見的為 O1、O2、O78、O35、O36等［14］，但本次試驗檢出了 O103、O6、O18、O178、O157和O55幾種血清型，這在山東地區(qū)鮮有報道，說明雞大腸埃希菌在本地區(qū)流行情況日趨復(fù)雜。尤其是本次試驗分離到的O157型，近年來在食品衛(wèi)生領(lǐng)域受到高度關(guān)注。該型（O157∶H7）的致病因子主要有志賀毒素、溶血素，主要通過食物傳播，也可經(jīng)水和人間接觸傳播，致病力強(qiáng)。發(fā)生溶血性尿毒綜合征之后死亡率極高，嚴(yán)重威脅人群健康，已成為不可忽視的流行病學(xué)與公共衛(wèi)生問題［15］。自1982年首次在美國發(fā)現(xiàn)以來，在世界范圍內(nèi)已發(fā)生過多次食源性暴發(fā)。據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查表明，部分禽、畜是O157型的貯存宿主［16］，本次試驗從雞的心、血中分離到該型，也證實了這種觀點(diǎn)。我國致病性微生物引起的食源性疾病現(xiàn)狀表明，由腸道致病菌污染食品而引起的食物中毒以及疾病散發(fā)是直接造成人體健康損害的主要食源性危害。因此，應(yīng)對我省家禽家畜和人群廣泛開展調(diào)查，切實做好監(jiān)測工作。通過被動監(jiān)測、主動監(jiān)測以及暴發(fā)監(jiān)測，及時掌握疫情動態(tài)，采取和改進(jìn)防治措施，防止大腸埃希菌O157∶H7引起流行和暴發(fā)流行。

另一方面，在不同地區(qū)、不同雞場均存在有不同的O抗原群別分布［17］，這使該病的防治不容樂觀，故建議養(yǎng)殖場應(yīng)定期監(jiān)測血清型動態(tài)變化，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做好環(huán)境衛(wèi)生消毒，變被動為主動 ，減少損失。

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Serotype Screening and Virulence Test on Avian PathogenicE.coliin Some Areas of Shandong Province

JIA Ning1，WANG Ping2，LU Hong3，GUO Yan-yan2，YANG Chao-qun2，ZHENG Xiao-qi4，YIN Yan-bo1

（1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao，Shandong，266109，China；2.QingdaoOLand-BetterBioengineeringCo.，LTD，Qingdao，Shandong，266101，China；3.AnimalHusbandryBureauofQingdao，Qingdao，Shandong，266000，China；4.CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu，Sichuan，610041，China）

Through the collection of chicken in some areas of Shandong province，the avian pathogenicE.coliserotype distribution and pathogenic characters had been analyzed in this study.80strains ofE.coliwere isolated from 108diseased chickens and the rate of isolation was 74.0%.According to the serotype identification experiment，74strains which was characterized for O were identified and they were classified as 9serotypes，including O2，O78，O157，O35，O103，O6，O18，O178，O55.The results showed that O2，O35，O78were the predominant serotypes in Shandong province.They accounted for 61.2%of the identified strains and 56.2%of the total strains，indicating the avianE.coliin Shandong province is very complicated.

avianE.coli；pathogenicity；serotype

S852.612

A

1007-5038（2013）06-0092-04

2013-02-22

賈 寧（1987－），男，山東青島人，碩士研究生，主要從事動物傳染病防控及生物制品學(xué)研究。＊通訊作者