翁曉琴，張紅，詹莉芳，張曉磊，生秀梅，徐順高，黃新祥

(江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)是一種人類重要的致病性革蘭陰性桿菌，通過(guò)食源性傳播導(dǎo)致一種全身系統(tǒng)性疾病—傷寒癥，這種疾病在不發(fā)達(dá)地區(qū)仍有暴發(fā)［1］。細(xì)菌可以適應(yīng)廣范圍的外環(huán)境滲透壓變化，其分子機(jī)制非常復(fù)雜［2］，例如傷寒沙門菌從食物的低滲環(huán)境突然進(jìn)入腸道的高滲環(huán)境中，為了抵御高滲應(yīng)激，許多細(xì)胞膜蛋白的表達(dá)量會(huì)發(fā)生變化，特別是那些周質(zhì)蛋白(periplasmic protein)，如ProU和OsmY 蛋白等［3－4］。

在大腸埃希菌中，osmY基因是一種滲透壓誘導(dǎo)基因，其表達(dá)依賴于RpoS的激活［5］。在高滲應(yīng)激的條件下，osmY基因的表達(dá)量明顯升高8～10倍，能編碼一種相對(duì)分子質(zhì)量約22×103的周質(zhì)蛋白OsmY，有研究者推測(cè)OsmY蛋白是運(yùn)輸某種滲透物的載體，但其確切功能至今未知［6］。我們通過(guò)基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，在高滲應(yīng)激早期，傷寒沙門菌osmY基因缺陷株與野生株相比，有許多重要功能的基因表達(dá)發(fā)生變化，其中包括Vi莢膜基因、菌毛基因和侵襲相關(guān)基因等［7］。所以我們猜測(cè)，在高滲應(yīng)激的環(huán)境下，OsmY蛋白可能作為一個(gè)重要蛋白參與調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)，或者與其他相關(guān)蛋白相互作用來(lái)幫助細(xì)菌抵御高滲環(huán)境。

本研究擬克隆表達(dá)重組蛋白OsmY－His6并制備兔抗重組蛋白的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究OsmY蛋白在高滲應(yīng)激環(huán)境中所發(fā)揮的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 野生型 S.Typhi GIFU 10007由日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室饋贈(zèng);E.coli JM109(DE3)和質(zhì)粒 pET22b(+)由本室保存。

1.1.2 主要試劑與材料 DNA聚合酶pfu和預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)參照物均為Fermentas公司產(chǎn)品;rTaq、緩沖液、dNTP、DL2000、限制性內(nèi)切酶 NcoⅠ和 XhoⅠ、T4DNA連接酶均為TaKaRa(大連)公司產(chǎn)品;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品;IPTG為Promega公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)，凝膠成像分析系統(tǒng)和蛋白電泳儀(Bio－Rad)，PCR擴(kuò)增儀2720 Thermal Cycler(ABI)，核酸檢測(cè)儀(Nano－Drop)，恒溫?fù)u床(Thermo scientific)，JY92－IIDN 超聲破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 家兔2只(江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和目的基因的獲取 利用基因庫(kù)獲取傷寒沙門菌osmY基因的核苷酸序列618 bp，通過(guò)Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)PCR特異性上下游引物P－osmY－A/B，并分別在引物5'端加接NcoⅠ和XhoⅠ的特異性酶切序列，由上海生工生物技術(shù)公司合成，P－osmY－A:

GACCATGGATATGACTATGACAAGACTG(下劃線為 NcoⅠ酶切位點(diǎn))，P－osmY－B:

ATCTCGAGCTGAACTTTCAGATCGTT(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。從LB平板挑取傷寒沙門菌GIFU 10007菌落，加入1 mL去離子水并振蕩混勻，100℃ 煮10 min，離心取上清(含基因組DNA)，以上清為模板，以P－osmY－A/B為引物，用高保真 DNA聚合酶 pfu擴(kuò)增目的基因osmY。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 用酚仿－乙醇法純化PCR產(chǎn)物，純化后的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET22b(+)經(jīng)NcoⅠ和Xho I雙酶切后，酶切產(chǎn)物經(jīng)酚仿－乙醇法純化后用T4DNA連接酶4℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化入E.coli JM109，從轉(zhuǎn)化平板上挑取24個(gè)菌落接種在24等份含氨芐西林的LB平板上增菌培養(yǎng)過(guò)夜，將上述菌體和空載體轉(zhuǎn)化菌體收集于30 μL蒸餾水的EP管中，向EP管中再加30 μL 酚/氯仿/異戊醇(25 ∶24 ∶1)混合液，在振蕩器上劇烈振蕩，離心取10 μL上清，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳初步篩選含陽(yáng)性質(zhì)粒的細(xì)菌。提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，用PCR和雙酶切驗(yàn)證陽(yáng)性質(zhì)粒，再通過(guò)DNA測(cè)序分析確認(rèn)陽(yáng)性質(zhì)粒的序列正確(測(cè)序分析由上海生工生物技術(shù)公司完成)。原理見(jiàn)圖1。

圖1 傷寒沙門菌pET22b(+)-osmY重組質(zhì)粒的構(gòu)建原理Fig 1 The schematic diagram of the pET22b(+)-osmY vector of S.Typhi

1.2.3 OsmY蛋白表達(dá)條件 挑取分別含重組質(zhì)粒 pET22b(+)－osmY和空質(zhì)粒 pET22b(+)的E.coli JM109于1 mL LB培養(yǎng)液中(氨芐西林0.1 mg/mL)，37℃振搖過(guò)夜，然后以1∶100的比例轉(zhuǎn)接入20 mL LB培養(yǎng)液中，37℃振搖2～3 h至D(600 nm)為0.5，加入 TPTG 至終濃度為1 mmol/L，于18 ℃振搖誘導(dǎo) 12 h［8］，冰浴 10 min，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，用500 μL PBS緩沖液重懸菌沉淀，250 μL菌液用于全菌蛋白電泳，另外250 μL菌液用于4℃超聲至清亮，12 000 r/min離心15 min，取上清和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE電泳。

1.2.4 OsmY蛋白的純化 用上述誘導(dǎo)條件1 000 mL培養(yǎng)重組表達(dá)菌，冰浴 10 min，4℃，10 000 r/min離心10 min后取菌沉淀，并用PBS緩沖液(pH7.2)洗滌3次，將菌沉淀稱重，在菌沉淀中加入相應(yīng)體積的非變性結(jié)合緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L 咪 唑 pH 8.0)(10 mL非變性結(jié)合緩沖液/1 g菌)，4℃超聲破碎后，4℃ 12 000 r/min離心30 min，收集上清液。用非變性結(jié)合緩沖液平衡Ni柱，再將收集的上清液以1 mL/min的速度上樣于Ni柱，用非變性洗滌緩沖液 (50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑 pH 8.0)洗滌雜蛋白，直至紫外分光光度儀檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度接近0 μg/mL，此時(shí)用非變性洗脫緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑 pH 8.0)洗脫融合蛋白，共收集5 mL，用紫外分光光度儀檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度并用SDS－PAGE電泳鑒定純度。

1.2.5 兔抗 OsmY蛋白多克隆抗體的制備 用PBS緩沖液透析收集的融合蛋白OsmY－His6以去除咪唑，將透析好的融合蛋白OsmY－His6與等體積的弗氏完全佐劑研磨至完全乳化，每只家兔以1 mL乳化的免疫原(含50 μg融合蛋白)，背部皮下多點(diǎn)注射。每隔2周將抗原與等體積的弗氏不完全佐劑研磨至乳化后免疫家兔，共免疫4～5次，末次免疫1周后頸動(dòng)脈放血并獲得抗血清，用半飽和硫酸銨鹽析法和透析除鹽法獲得粗提的多克隆抗體，分裝后保存于－20℃［9］。用雙向免疫瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抗體效價(jià)，用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)多克隆抗體與抗原反應(yīng)的特異性。

2 結(jié)果

2.1 傷寒沙門菌 pET22b(+)－osmY重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以S.Typhi野生株 GIFU 10007為模板，PCR擴(kuò)增得到約633 bp的DNA片段，經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后與表達(dá)載體pET22b(+)相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli JM109，篩選陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，并提取初篩陽(yáng)性質(zhì)粒pET22b(+)－osmY，經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切與PCR鑒定，osmY基因已經(jīng)成功與表達(dá)載體pET22b(+)相連(圖2)。

2.2 重組蛋白OsmY－His6的表達(dá)與純化

帶有重組質(zhì)粒 pET22b(+)－osmY的 E.coli JM109在18℃、TPTG終濃度為1 mmol/L的條件下誘導(dǎo)12 h后，經(jīng)SDS－PAGE電泳鑒定:在超聲后上清中可見(jiàn)大量的重組蛋白OsmY－His6，該上清經(jīng)Ni柱純化后獲得重組蛋白OsmY－His6(圖3)。

圖2 傷寒沙門菌pET22b(+)-osmY重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig 2 Preparation of the pET22b(+)-osmY vector of S.Typhi

圖3 重組蛋白OsmY-His6的表達(dá)與純化Fig 3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein OsmY-His6expression and purification

2.3 兔抗OsmY－His6蛋白的多克隆抗體制備

以純化的OsmY－His6蛋白為免疫原免疫家兔，獲得兔抗OsmY－His6的多克隆抗體，用雙向免疫瓊脂擴(kuò)散測(cè)定效價(jià)為1∶8。蛋白質(zhì)印跡顯示多克隆抗體與抗原反應(yīng)的特異性良好(圖4)。

圖4 抗體特異性的免疫印跡鑒定Fig 4 Western-blotting analysis of the anti-OsmY polyclonal antibody

3 討論

傷寒沙門菌(S.Typhi)是沙門菌屬中一種重要的人類腸道致病菌，通過(guò)污染的食物進(jìn)入消化道后，侵入空腸M上皮細(xì)胞，并能在M細(xì)胞中存活和增殖，最終可穿過(guò)腸系膜淋巴組織進(jìn)入淋巴循環(huán)和血液循環(huán)，從而進(jìn)入肝、脾和腎等臟器，造成系統(tǒng)性感染［10］。在這個(gè)致病過(guò)程中，傷寒沙門菌需要克服腸道的高滲環(huán)境，其分子機(jī)制非常復(fù)雜，主要通過(guò)兩種途徑:一是蛋白活性的調(diào)節(jié)，作為一種立即反應(yīng);二是基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，作為一種長(zhǎng)期反應(yīng)。細(xì)菌必需產(chǎn)生許多化學(xué)分子將環(huán)境外部的刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部，從而來(lái)實(shí)現(xiàn)這兩種途徑［11］。

大腸埃希菌在高滲應(yīng)激的條件下，周質(zhì)空間中的某些蛋白的表達(dá)量增多，如ProU和OsmY蛋白等［3－4］。周質(zhì)空間又稱壁膜空間，位于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的狹窄間隙，含有多種蛋白質(zhì)，例如蛋白酶、核酸酶等各種水解酶和運(yùn)送某些物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合蛋白，以及趨化性的受體蛋白等。osmY基因是一種滲透壓誘導(dǎo)基因，在高滲應(yīng)激的條件下，其表達(dá)量明顯升高8～10倍，能編碼相對(duì)分子質(zhì)量約為22×103的周質(zhì)蛋白OsmY。所以有研究者推測(cè)OsmY蛋白是運(yùn)輸某種滲透物的結(jié)合蛋白，但其確切功能至今未知［6］。我們的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與傷寒沙門菌野生株相比，osmY基因缺陷株在高滲應(yīng)激早期，有許多基因的表達(dá)量發(fā)生顯著變化，有表達(dá)量上調(diào)的基因(tviA、fimA、treC等)和表達(dá)量下調(diào)的基因(otsB、fimA、rpoS 等)［7］。據(jù)此，我們猜測(cè) OsmY 蛋白在高滲應(yīng)激的條件下可能有3種作用，一是作為調(diào)節(jié)蛋白來(lái)調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá);二是與其他相關(guān)蛋白相互作用來(lái)調(diào)節(jié)蛋白活性;三是作為結(jié)合蛋白來(lái)運(yùn)輸某種滲透物。

本研究克隆表達(dá)了重組蛋白OsmY－His6并制備兔抗重組蛋白的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究OsmY蛋白在高滲應(yīng)激環(huán)境中所發(fā)揮的功能提供了基礎(chǔ)。

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