嚴妍，楊茂，Wolf-dieter Rausch，王喜軍

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院心內科，黑龍江 哈爾濱 150001;3.Department of Biomedical Sciences，Veterinary Medical University，Vienna，Austria，A-1210)

烏頭堿(aconitine)來自于烏頭屬植物中所含的二萜類生物堿成分，幾個世紀以來，烏頭屬植物作為祛風除濕止痛功效的藥物，始終被中國和日本等國家的不同人群使用。烏頭堿的治療作用和毒性作用，發(fā)作時均反應迅速，可在幾分鐘內發(fā)生，且發(fā)生時與刺激電位的鈉離子通道有關，這同樣也是烏頭堿產生神經毒素和心臟毒素的致毒機理所在［1－3］。烏頭堿作為心臟毒素目前已被廣泛和全面地研究，但對其神經毒性方面的研究甚少，僅僅集中在臨床病例報道和癥狀描述方面。本實驗從胎鼠原代中腦神經元細胞培養(yǎng)的層面研究烏頭堿的神經毒性作用，通過神經元標志物信息的檢測和提取來評價烏頭堿對中腦神經元細胞的藥理毒理作用，以更好地了解和預防烏頭堿及其衍生物產生的神經毒性作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器和試劉

懷孕14 d的OF1/SPF小鼠，由奧地利Himburg醫(yī)科大學動物中心提供。

層流式工作臺(Holten Laminair，丹麥);NAPCO5410孵育箱(德國);倒置顯微鏡(Nikon);SMZ-1B解剖顯微鏡(Nikon)。

烏頭堿(Sigma公司);ABC免疫組化試劑盒(Vector laboratories，USA);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(德國 Sigma-Aldrich公司);二甲基亞砜(DMSO)(德國Merck公司);杜爾貝科磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)、胰蛋白酶及胰蛋白酶抑制劑(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 中腦原代細胞培養(yǎng) 對OF1/SPF孕鼠的飼養(yǎng)及實驗，均在歐洲聯(lián)盟理事會(86/609/EU)的指導方針下進行。處死懷孕14 d的小鼠，乙醇消毒后打開腹腔，游離出子宮于新鮮DPBS溶液的平皿中，在層流式工作臺上的解剖顯微鏡下取出胎鼠中腦，用纖維解剖刀將其切碎后轉移至無菌試管內，加入2 mL 0.1%胰酶和2 mL 0.02%DNA消化酶，于37℃水浴箱內消化7 min。取出后加入2 mL胰酶抑制劑終止消化，于750 r/min條件下離心4 min，移除上清液后試管內加入3 mL基礎培養(yǎng)基和6 μL DNA消化酶，用火焰拋光后的吸管吹打使細胞分散，靜置10 min后取上清液，重復3次。取3 μL細胞溶液經臺盼藍染色，顯微鏡下計數(shù)后，調整細胞密度至750 000/mL。將細胞溶液加至4孔培養(yǎng)皿中，放置于5%CO2、37℃及100%濕度的孵育箱內培養(yǎng)。

1.2.2 烏頭堿溶液的配制 以DMSO溶解配制濃度為 0.1，0.5，1，5，10，50 和 100 μmol/L 的烏頭堿溶液，未加藥物的為對照組。藥物溶液用N-4培養(yǎng)液稀釋。DMSO在培養(yǎng)液中的濃度為0.01%。

1.2.3 烏頭堿作用于原代多巴胺能神經元細胞在多巴胺能神經元體外培養(yǎng)的第10天，將不同濃度的烏頭堿溶液加入到培養(yǎng)皿中，并繼續(xù)放置在5%CO2，37℃及100%濕度的孵育箱內作用48 h。

1.2.4 免疫組化鑒定酪氨酸羥化酶陽性(TH+)細胞 在體外培養(yǎng)的第12天移除培養(yǎng)液，以PBS洗滌后每孔加入可溶性聚四氟乙烯(PFA)0.4 mL，4℃條件下保存20 min，PBS溶液洗滌1次，2 min后每孔加入X-100溶液室溫下保存30 min，PBS洗滌3次，每次2 min。加入馬血清孵育90 min后加一抗(兔抗鼠多克隆抗體)4℃下過夜。第2天以PBS洗滌3次，每次2 min，加二抗(生物標記的山羊抗兔抗體)室溫下保存1.5 h，PBS洗滌3次，每次5 min。加ABC免疫組化試劑盒，室溫下保存1.5 h，以濃度為1.4 mmol/L的DAB室溫避光下孵育10～15 min，移除DAB并以PBS洗滌后，加Kaiser's甘油明膠固定。細胞膜或胞質內出現(xiàn)棕色產物的細胞為TH陽性(TH+)細胞，即為多巴胺能神經元。

1.2.5 多巴胺能神經元細胞的形態(tài)學觀察 使用Nikon倒置顯微鏡200×放大倍率下觀察不同濃度的烏頭堿作用下的TH+細胞的形態(tài)變化，與對照組的正常細胞生長趨勢做比較。

1.2.6 多巴胺能神經元細胞的計數(shù) 在Nikon倒置顯微鏡100×放大倍率下每孔隨機選取密度均勻的14個視野，記錄TH+細胞個數(shù)，每個視野為1 cm2。

1.2.7 多巴胺能神經元樹突的長度測量 使用倒置顯微鏡及Moticam 1 000相機200×放大倍率下，每孔隨機選擇10個細胞，應用軟件Motic Images Plus 2.0測量照片中神經元細胞的樹突長度。

1.2.8 多巴胺能神經元樹突的計數(shù) 使用倒置顯微鏡及Moticam 1000相機200×放大倍率下，記錄多巴胺能神經元細胞樹突的數(shù)量，每孔隨機選擇10個細胞。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 烏頭堿對中腦多巴胺能神經元細胞形態(tài)的影響

不同濃度的烏頭堿作用于培養(yǎng)10 d的中腦多巴胺能神經元細胞48 h后，于培養(yǎng)第12天進行免疫組化染色，在倒置顯微鏡200×放大倍率下可見，對照組神經細胞的胞體飽滿，突觸分支較多，神經纖維較長;而50 μmol/L和100 μmol/L烏頭堿作用后的神經元細胞胞體出現(xiàn)明顯皺縮，突觸呈斷裂狀態(tài)，神經纖維萎縮變短，甚至缺失(圖1)。

圖1 烏頭堿作用下的多巴胺能神經元酪氨酸羥化酶陽性細胞的形態(tài)學觀察(免疫組化染色×200)Fig 1 Morphological observation of TH+cells in dopaminergic neurons with treatments of aconitine

2.2 烏頭堿對中腦多巴胺能神經元細胞數(shù)的影響

烏頭堿加入培養(yǎng)細胞中作用48 h后，與對照組相比，100，50和10 μmol/L烏頭堿作用下的多巴胺能神經元細胞計數(shù)分別降低45%，31%和17%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)，見表 1，圖2。

2.3 烏頭堿對中腦多巴胺能神經元樹突長度的影響

測量多巴胺能神經元樹突長度發(fā)現(xiàn)，烏頭堿溶液加入到細胞中作用48 h后，各濃度組的細胞樹突長度均有不同程度的縮短，與對照組相比具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。其中，高濃度的烏頭堿對多巴胺能神經元樹突長度的影響比低濃度的烏頭堿的作用更為顯著，見表1，圖2。

2.4 烏頭堿對中腦多巴胺能神經元樹突數(shù)量的影響

烏頭堿作用于細胞48 h后，其對神經元樹突數(shù)量的影響呈現(xiàn)濃度依賴關系。與對照組相比，100，50和10 μmol/L烏頭堿作用下的多巴胺能神經元樹突計數(shù)分別降低54%，53%和39%，低濃度烏頭堿(5，1 和 0.5 μmol/L)作用后，多巴胺能神經元樹突數(shù)量分別降低28%，16%和12%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表1，圖2。

表1 烏頭堿對多巴胺能神經元細胞數(shù)、樹突長度和樹突數(shù)量的影響Tab 1 Influences of aconitine on the cell numbers，the lengths and numbers of dendritic of dopaminergic neurons

圖2 不同濃度烏頭堿作用下的多巴胺能神經元TH+細胞數(shù)、樹突長度及數(shù)量的變化(×100)Fig 2 Microscopic changes of the cell numbers，the lengths and numbers of dendritic of TH+neurons with different concentrations of aconitine.

3 討論

無法控制的顫抖和運動障礙是烏頭屬植物引起神經毒性的典型癥狀，這種癥狀與多巴胺能神經通路的變性有關，亦有報道稱烏頭堿能引起多巴胺能神經毒性［4－6］。多巴胺能神經元為神經毒性藥物的研究提供了良好的體外模型，而關于烏頭堿對多巴胺能神經元的影響方面的研究，至今尚未見報道，因此，本實驗選用中腦多巴胺能神經元進行細胞培養(yǎng)。胎鼠中腦原代多巴胺能神經元培養(yǎng)可以幫助了解神經退行性疾病的發(fā)病過程和機制，作為常用的體外模型目前已經廣泛應用于各種毒理藥理實驗。

本實驗結果表明不同濃度的烏頭堿(0.5～100 μmol/L)，對神經細胞生長均有顯著的抑制作用，并表現(xiàn)出濃度依賴性神經細胞毒作用;高濃度烏頭堿(10～100 μmol/L)的抑制強度高于低濃度組(0.5～5 μmol/L)。此外，從TH陽性細胞的顯微圖像可以看出，烏頭堿濃度的增加使中腦多巴胺神經細胞樹突的長度和數(shù)量呈減少的趨勢，并使細胞的形態(tài)發(fā)生改變，胞體出現(xiàn)收縮、變形、纖維縮短、數(shù)量減少等。

烏頭堿對人的半數(shù)致死量(LD50)為2～4 mg(3～6 μmol/L)，但僅僅取決于臨床的醫(yī)療規(guī)定。根據(jù)烏頭堿的分子質量645.74 g/mol，我們可以從本實驗結果中的烏頭堿在細胞培養(yǎng)中的毒性濃度計算出成年人給予相同濃度的烏頭堿的劑量，結果這個劑量將是非常高的致死劑量，并不能用于臨床使用。因此，針對烏頭堿的神經毒性來說，只有在相對高的濃度下，烏頭堿才會表現(xiàn)出神經毒性和引起細胞死亡。在本實驗中，低濃度的烏頭堿對神經元的結構也造成了一定程度的破壞，這一結果等同于在體內功能受到干擾，從而引起漸進的神經退行性疾病。所以，體外實驗不能模擬藥物在體內的累積效應，同樣在體外細胞模型上進行的藥物實驗劑量不能直接延伸到臨床的治療劑量。本次體外細胞培養(yǎng)實驗研究中所得的結果，即烏頭堿的神經毒性作用，今后有待在動物體內實驗模型中實現(xiàn)驗證。

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