陳 婷 朱曉良 杜紫燕

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 蘇州 215004)

肺血栓栓塞(PTE)發(fā)生機(jī)制主要為血栓性或者其他性質(zhì)栓子(包括羊水、氣體、脂肪)隨體循環(huán)方向流動(dòng)而造成肺動(dòng)脈栓塞〔1，2〕。PTE的栓子主要來自下肢深靜脈血栓，血栓或栓子直接堵塞造成肺動(dòng)脈發(fā)生痙攣，肺血管床供血能力下降、供應(yīng)面積減少，肺血管阻力逐漸增加并且肺動(dòng)脈壓逐漸增高〔3，4〕，危重者導(dǎo)致右心功能不全，甚至休克、死亡。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是促進(jìn)并且誘導(dǎo)特異性血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的細(xì)胞因子，在血管生成過程中起到了重要的作用〔5〕。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)主要作用有促進(jìn)血管生成，同時(shí)對(duì)體內(nèi)氧氣運(yùn)輸及通氣進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)對(duì)各種酶的酵解作用進(jìn)行調(diào)控以利于提高機(jī)體對(duì)缺氧的耐受能力〔6〕。本文制備大鼠急性肺栓塞(APE)模型并研究VEGF、HIF-1表達(dá)水平。

1 材料和方法

1.1 材料 Wistar大鼠50只，雌雄各半，體重為200～220 g，大鼠均由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，包括兔抗大鼠多克隆抗體、兔抗大鼠單克隆抗體VEGF一抗、HIF-1一抗及鏈霉素合素以生物素復(fù)合物(SABC)試劑盒等均由美國Sigma公司提供。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自武漢博士德。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 建立APE大鼠模型，采用改良右心導(dǎo)管術(shù)建立自體血栓APE大鼠模型〔7〕:腹腔注射20%烏拉坦6 ml/kg麻醉，必要時(shí)追加0.5 ml/h，無菌條件下沿頸前正中線做長約2 cm切口，鈍性分離右頸外靜脈，插管接YP100型壓力傳感器，量程為(－10～10 KPa)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肺動(dòng)脈壓變化。從頸動(dòng)脈采血1 ml，迅速注入聚乙烯導(dǎo)管內(nèi)。室溫下放置30 min左右，在凝固后加入生理鹽水，制備直徑0.8～0.9 mm、長10 mm的自體血栓。取50只Wistar大鼠，正常組10只，其余40只按取肺組織時(shí)間不同，分為 1、6、12、24 h四組，每組 10只。大鼠采用10 g/L戊巴比妥1.2 ml進(jìn)行麻醉，從頸總靜脈插管將栓子注入，注栓速度為0.5 ml/s，保持肺動(dòng)脈收縮壓持續(xù)為50 mmHg，每只注入3個(gè)栓子，正常對(duì)照組注入等量的生理鹽水。采用正常組為對(duì)照，在1、6、12及24 h分別進(jìn)行開胸留取肺組織。

1.3 免疫組化學(xué)法 用4%水合氯醛以10 ml/kg腹腔注射麻醉后開胸，將針頭插入左心室，剪開右心耳，先用200 ml生理鹽水灌流將血沖凈，然后用250 ml的4%多聚甲醛灌流固定，取組織，石蠟包埋。切片常規(guī)脫蠟至水，30%H2O2阻斷，枸櫞酸鹽緩沖液加熱抗原修復(fù)，5%胎牛血清(BSA)封閉，37℃下放置30 min，滴加稀釋的一抗(按1∶200稀釋)，4℃過夜。次日依操作順序加入二抗及SABC，室溫DAB顯色，封片后應(yīng)用顯微鏡觀察。

1.4 結(jié)果判定 HIF-1α陽性結(jié)果顯示為鏡下出現(xiàn)細(xì)胞核或者胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒，并根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行打分:無色(0分)，淺黃色(1分)，棕黃色(2分)，棕褐色(3分);再依據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行打分:陽性細(xì)胞＜5(0分)，5～25(1分)，25～50(2分)，50～75(3分)，＞75(4分);染色強(qiáng)度同陽性細(xì)胞百分比乘積進(jìn)行評(píng)分:9～12分(強(qiáng)陽性?)，5～8分是弱陽性(+)，0～4分是陰性(－)，VEGF陽性細(xì)胞判定主要依據(jù)Takahashi等實(shí)驗(yàn)方法依據(jù)細(xì)胞漿或者胞膜鏡下棕黃色者為陽性，將VEGF表達(dá)共可分為(－)～(?)4級(jí)。采用Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定實(shí)驗(yàn)切片的光密度值，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，均值比較應(yīng)用單因素方差分析，而HIF-1和VEGF之間的相關(guān)性應(yīng)用直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 模型制備結(jié)果 制備APE大鼠模型過程中，僅有2只死亡，其制備成功率為95%(38/40)，注入栓子5 min左右，大鼠的肺動(dòng)脈壓明顯升高，并出現(xiàn)呼吸加深加快，30次/min，口唇紫紺，活動(dòng)明顯減少，多為俯臥位，雙肺彌漫性干濕啰音等肺栓塞體征。經(jīng)頸靜脈注栓后1 h，自頸外靜脈給予放射性核素99 mTC-MAA，術(shù)后經(jīng)ECT肺灌注掃描顯示雙肺呈明顯放射性充盈及缺損。隨時(shí)間的延長，大鼠逐漸適應(yīng)缺氧現(xiàn)象，24 h后活動(dòng)量逐漸增加。蘇木素一伊紅(HE)染色可見肺動(dòng)脈及小血管內(nèi)存在大小不等的栓子，周圍有大量炎性細(xì)胞聚集，伴血管內(nèi)膜不同程度水腫及局部肺組織實(shí)質(zhì)變。

2.2 HIF-1α和VEGF的表達(dá) 正常組大鼠肺組織內(nèi)顯示無HIF-1α表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)組大鼠的肺組織在細(xì)胞胞核及胞漿內(nèi)于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯示 HIF-1α表達(dá)(陽性率100%)，強(qiáng)度為(?)～(?)，VEGF、HIF-1蛋白表達(dá)水平均升高，與對(duì)照組相比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=4.274，t2=5.137，均 P＜0.05)，表達(dá)強(qiáng)度與時(shí)間呈正相關(guān)，在模型制作12 h時(shí)升高最為顯著。通過觀察栓塞后大鼠肺組織中HIF-1α和VEGF在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其兩者表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)(r=0.800，P＜0.05)。見表1，表2。

表1 HIF-1α在大鼠肺組織內(nèi)的表達(dá)(n=10)

表2 VEGF在大鼠肺組織內(nèi)的表達(dá)(n=10)

3 討論

本研究結(jié)果表明PTE疾病介導(dǎo)的缺氧肺組織中主要存在HIF-1α，其主要通過對(duì)VEGF表達(dá)調(diào)節(jié)來降低肺細(xì)胞的耗氧量，從而在缺氧狀態(tài)下增強(qiáng)肺細(xì)胞的耐受能力，增強(qiáng)肺細(xì)胞耐缺氧能力。

VEGF主要作用包括促進(jìn)血管內(nèi)皮生長及側(cè)支循環(huán)的建立，在血管生成中起到關(guān)鍵作用，作為具有高度特異性受體的血管內(nèi)皮細(xì)胞因子，主要和特異性受體flk-1相結(jié)合，發(fā)揮介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及分化作用;利于血管通透性增加并同時(shí)參與新生血管形成。缺氧是刺激VEGF生成的最關(guān)鍵因素。經(jīng)研究證實(shí)〔8，9〕，在低氧環(huán)境中 VEGF mRNA及 VEGF蛋白表達(dá)較高，顯示新生血管的生成及其側(cè)支循環(huán)的建立是通過對(duì)VEGF基因表達(dá)的調(diào)控達(dá)到最終目的。位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF受體可經(jīng)VEGF因子激活，從而激活下游系列缺血相關(guān)通路起誘導(dǎo)新生血管生成及側(cè)支循環(huán)建立〔10〕。

綜上所述，在APE模型中VEGF、HIF-1均可作為治療靶點(diǎn)，且HIF-1表達(dá)可能起到啟動(dòng)作用，臨床治療可以參照相關(guān)理論依據(jù)進(jìn)行靶點(diǎn)治療，保護(hù)肺組織。

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