王學(xué)慧 毛旭強(qiáng)

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院，江蘇 無錫 214008)

缺血性腦梗死是一種致殘和致死率較高的腦血管疾病，好發(fā)于老年人。在缺血性腦損傷中，多種凋亡誘導(dǎo)信號是造成神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要原因。其中炎性因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α和細(xì)胞凋亡因子Bcl-2與其最為密切相關(guān)〔1〕。有研究表明，局灶性腦缺血時(shí)，過度的炎性反應(yīng)會對機(jī)體及患者的預(yù)后產(chǎn)生不良影響。但目前，炎性因子和細(xì)胞凋亡因子的動態(tài)變化對腦梗死后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系尚未闡明〔2〕。本研究旨在探討炎性因子IL-1β、TNF-α和Bcl-2在腦梗死后的動態(tài)變化，揭示腦缺血/再灌注時(shí)神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SD雄性大鼠，8～9周齡，體重280～320 g，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供;IL-1β雙抗體一步夾心法ELISA檢測試劑盒由上海逸峰生物科技有限公司提供;TNF-α雙抗體一步夾心法ELISA檢測試劑盒由上海研吉生物科技有限公司提供;TUNEL試劑盒由Roche公司提供;兔抗Bcl-2抗體由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。

1.2 腦梗死大鼠模型制備 將60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組及再灌注6、12、24、48和96 h組，大鼠模型制備前禁食不禁水12 h，并在室溫環(huán)境下，腹腔注射1.0%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉。參照Longa等〔3〕的方法，采用插線法致大鼠大腦中動脈栓塞2 h。模型組大鼠仰臥固定在手術(shù)臺，消毒后行頸正中切口，分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)，在CCA和ECA近心端處永久結(jié)扎，臨時(shí)夾閉ICA，在CCA近分叉處剪一斜行切口，并緩慢插入尼龍線，至1.8～2.1 cm處遇到阻擋感時(shí)即停止插線，從而造成大腦中動脈局灶性缺血，梗死2 h后，拔出線栓。假手術(shù)組除不插入尼龍線外，其余操作與模型組一樣。并分別在再灌注6、12、24、48和96 h對部分大鼠取腹主動脈血，另一部分大鼠斷頭取腦，石蠟包埋。

1.3 檢測方法

1.3.1 IL-1β和TNF-α的檢測 各組大鼠在手術(shù)結(jié)束時(shí)，剝離右側(cè)大腦皮質(zhì)制備勻漿液，取上清液進(jìn)行蛋白定量。分別按照IL-1β、TNF-α雙抗體一步夾心法ELISA檢測試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

1.3.2 組織病理學(xué)觀察與TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 部分石蠟常規(guī)脫蠟至水，然后行HE染色，脫水，封片，在光學(xué)顯微鏡下即可觀察腦細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照。另取部分石蠟切片經(jīng)脫蠟、水合后，按TUNEL試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，以染成深棕色的為凋亡細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下即可觀察。選取20倍物鏡拍照，采用陽性染色像素計(jì)數(shù)計(jì)算凋亡細(xì)胞總數(shù)。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法 部分石蠟切片脫蠟至水，放入3%H2O2室溫孵育 5 min，再移入 10 mmol/L PBS浸泡 2次(5 min/次)后，置入5%山羊血清，室溫孵育10 min。滴加一抗工作液，4℃孵育過夜。10 mmol/L PBS沖洗3次(5 min/次)后，滴加二抗工作液，37℃孵育30 min。10 mmol/L PBS沖洗3次(5 min/次)后，滴加辣根酶復(fù)合物工作液，37℃孵育30 min。10 mmol/L PBS沖洗3次(5 min/次)后，滴加DAB顯色劑顯色5～15 min(由染色程度決定顯色時(shí)間)。自來水充分沖洗、脫水、透明、封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 炎性反應(yīng)在腦梗死后的動態(tài)變化 IL-1β水平在再灌注6 h顯著升高，在12 h達(dá)到最高，24 h則開始下降，但仍顯著高于假手術(shù)組的水平(P＜0.05或P＜0.01);與假手術(shù)組比較，TNF-α在再灌注6、12 h無明顯變化，在24 h顯著升高(P＜0.05)，48 h達(dá)到最高(P＜0.01)。見表1。

2.2 細(xì)胞凋亡在腦梗死后的動態(tài)變化 神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量在再灌注6 h顯著降低(P＜0.05)，至48 h降到峰值(P＜0.01)，96 h后已基本恢復(fù);細(xì)胞凋亡數(shù)量在再灌注6 h開始升高，到24 h達(dá)到最高，48 h開始下降，至96 h仍顯著高于假手術(shù)組的數(shù)量(P＜0.01);Bcl-2表達(dá)在再灌注6 h開始降低，以后各時(shí)相持續(xù)下降 ，顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01)。見表2。

表1 IL-1β、TNF-α水平在腦梗死后的動態(tài)變化(，n=10)

表1 IL-1β、TNF-α水平在腦梗死后的動態(tài)變化(，n=10)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

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表2 神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞凋亡及bcl-2表達(dá)在腦梗死后的動態(tài)變化，個(gè)/mm2)

表2 神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞凋亡及bcl-2表達(dá)在腦梗死后的動態(tài)變化，個(gè)/mm2)

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3 討論

在缺血性腦梗死患者中，神經(jīng)細(xì)胞死亡的方式有壞死和凋亡。而在發(fā)生缺血性腦梗死的整個(gè)病程中，神經(jīng)細(xì)胞的死亡方式同時(shí)存在壞死和凋亡〔4〕。為進(jìn)一步闡明腦缺血/再灌注時(shí)神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制，指導(dǎo)臨床研發(fā)抗缺血再灌注性腦損傷藥物，從而在有效防治腦梗死方面帶來一定的醫(yī)用價(jià)值，因此，本文通過建立局灶性腦缺血大鼠模型，并在再灌注6、12、24、48和96 h 5個(gè)時(shí)相點(diǎn)觀察炎性反應(yīng)與細(xì)胞凋亡的動態(tài)變化及探討其內(nèi)在機(jī)制。

本研究結(jié)果說明在局灶性缺血6 h后，神經(jīng)細(xì)胞死亡的方式主要是壞死;而在以后時(shí)間點(diǎn)，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少與細(xì)胞凋亡增加互相吻合，提示在急性缺血性腦梗死后期，經(jīng)細(xì)胞死亡的方式主要是凋亡〔5〕。

IL-1β是一種促炎性細(xì)胞因子，能通過間接增加白細(xì)胞，增強(qiáng)炎性反應(yīng)，從而加重缺血性腦損傷，最終誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔6〕。本研究結(jié)果說明過度的炎性反應(yīng)會增加細(xì)胞凋亡數(shù)量。TNF-α亦是一種促炎性細(xì)胞因子，可廣泛參與炎性反應(yīng)。局灶性腦缺血后，神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞等均可使TNF-α水平升高，從而加重腦組織損傷〔7〕。本研究結(jié)果說明神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量的增加可能與過高的TNF-α水平有關(guān)。Bcl-2是一種抗凋亡因子，對缺血腦組織細(xì)胞具有保護(hù)作用，能夠?qū)?xì)胞凋亡起到抑制作用〔8，9〕。神經(jīng)細(xì)胞凋亡與Bcl-2水平表達(dá)過低有關(guān)，抗凋亡因子bcl-2對細(xì)胞凋亡的抑制作用可能僅是一種生理保護(hù)作用〔10〕。

綜上所述，缺血性腦梗死后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的動態(tài)變化可能與炎性因子IL-1β、TNF-α水平的升降及Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

1 謝惠芳，徐如祥，魏繼鵬，等.炎性介質(zhì)阻斷劑對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺損、細(xì)胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶-3表達(dá)的影響〔J〕.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2009;22(3):199-202.

2 沈麗華，葉 民，丁新生，等.大鼠腦缺血再灌注后全腦及血清炎性因子水平研究〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2009;26(4):456-8.

3 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middlecerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84-91.

4 關(guān) 健，戴建武，佟偉民，等.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國微侵襲神經(jīng)外科雜志，2012;17(11):514-7.

5 心 敬，張麗香，羅永堅(jiān)，等.大鼠腦缺血半暗帶神經(jīng)元蛋白表達(dá)和凋亡的動態(tài)變化研究〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2012;14(11):1201-5.

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