劉紅彬 顧小龍

(河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000)

Wels等〔1〕構(gòu)建的免疫毒素可使裸鼠體內(nèi)的移植瘤消退。由美國(guó)國(guó)立癌癥研究所研制的新型免疫毒素BL22，在白血病臨床試驗(yàn)中更顯示了“生物魔彈”的神奇威力〔2〕。綠膿桿菌外毒素(PE)是有效的細(xì)胞殺傷劑，只要一個(gè)毒素分子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)就足以殺死細(xì)胞。PE是613肽的單鏈毒素蛋白，通過細(xì)胞識(shí)別區(qū)和跨膜區(qū)將具有ADP-核糖基化活性的毒性區(qū)導(dǎo)入細(xì)胞，催化細(xì)胞內(nèi)的延伸因子(EF-2)發(fā)生ADP-核糖基化反應(yīng)，使EF-2滅活而殺死細(xì)胞。據(jù)Hwang等〔3〕報(bào)道，缺失Ⅰa區(qū)的PE分子(即PE40)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的毒性很低，但卻具有完全的毒性活性，將PE40與抗體或生長(zhǎng)因子等導(dǎo)向分子連接，能選擇性殺傷特定靶細(xì)胞。因此，PE40作為毒素彈頭基因廣泛用于免疫毒素的研究〔4～6〕。利用PCR技術(shù)從綠膿桿菌ATCC9027基因組DNA中擴(kuò)增PE40基因，與pMD18-T simple載體連接后測(cè)序，獲得用于構(gòu)建分子免疫毒素的毒素彈頭基因PE40。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒 綠膿桿菌ATCC9027，購自廣東省微生物菌種保藏中心。感受態(tài)大腸桿菌JM109和pMD18-T simple vector購自寶生物大連公司。

1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、內(nèi)切酶HindⅢ和T4 DNA連接酶購自大連寶生物公司。

1.3 引物 根據(jù)綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)毒株P(guān)A103外毒素基因序列〔7〕，自行設(shè)計(jì)引物，上下游引物引入HindⅢ酶切位點(diǎn)，目的是為了將PE40亞克隆至表達(dá)載體，致上下游引物分別長(zhǎng)33 bp和 31 bp。上游引物:5'-AAGCTTATGGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTGACC-3';下游引物:5'-AAGCTTCTTCAGGTCCTCGCGCGGCGGTTTG-3';引物由上海生物工程有限公司合成

1.4 綠膿桿菌ATCC9027基因組DNA的制備 酚/氯仿法。

1.5 PCR反應(yīng)體系 2.5μl 10×PCR擴(kuò)增緩沖液，2μl dNTP混合物(10 mmol/L)，上下游引物各 0.5μl，1μlDNA模板(20 ng)，Taq DNA聚合酶0.5 μl，50%甘油5 μl，滅菌水13 μl，總體積25μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，接著進(jìn)入循環(huán)，94℃變性1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸 1.5 min，共循環(huán) 30個(gè)周期，72℃終末延伸10 min。取5μl PCR產(chǎn)物，在0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，美國(guó)伯樂凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.6 克隆PE40 純化PCR產(chǎn)物與PMD18-T simple載體16℃連接3 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布于含Amp、IPTG和X-Gal的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，將此克隆質(zhì)粒命名為pT-PE40?？寺≠|(zhì)粒經(jīng)HindⅢ酶切鑒定后測(cè)序。

1.7 序列比對(duì) 將獲得的PE40基因序列在Genbank中進(jìn)行blast搜索，下載一致性高的PE基因序列，以PE40基因序列為內(nèi)群，以白喉毒素基因?yàn)橥馊哼M(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。用ClustalX(2.0)軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，多序列比對(duì)參數(shù)為:空位開放罰分15;空位延伸罰分6.66;DNA轉(zhuǎn)換權(quán)重0.5;延遲趨異序列30%。比對(duì)結(jié)果用MegA 4.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 甘油對(duì)PCR的影響 綠膿桿菌外毒素基因PE40基因片段G+C含量高達(dá)72.56%，PE40基因片段的擴(kuò)增必須依賴于一定濃度的甘油。不加甘油時(shí)，PE40基因片段不能被成功擴(kuò)增;而甘油濃度超過20%時(shí)，PE40基因片段也不能被成功擴(kuò)增。甘油濃度為10%時(shí)，經(jīng)擴(kuò)增得到的PE40基因片段量最多。見圖1。

圖1 甘油對(duì)PCR的影響

2.2 克隆綠膿桿菌ATCC9027外毒素PE40基因 純化PCR產(chǎn)物與PMD18-T simple載體連接，電泳結(jié)果顯示陽性克隆質(zhì)粒為3 790 bp。見圖2。

2.3 酶切鑒定 酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示2條帶，T載體片段長(zhǎng)2 322 bp，PE40片段長(zhǎng)1 088 bp。見圖3。

2.4 綠膿桿菌ATCC9027外毒素PE40基因序列堿基突變分析 綠膿桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)毒株被命名為PA103，ATCC9027與PA103的PE40進(jìn)行核苷酸比對(duì)，一致性為98.8%，ATCC9027產(chǎn)生了14個(gè)堿基的突變，由此導(dǎo)致8個(gè)氨基酸的突變，對(duì)應(yīng)PA103外毒素蛋白一級(jí)序列為:甘胺酸354(GGC)→絲氨酸341(AGC)，丙氨酸362(GCG)→谷氨酸346(GAG)，天冬酰胺364(AAC)→絲氨酸364(AGC)，纈氨酸Val419(GTG)→谷氨酸419(GAG)，絲氨酸506(TCG)→色氨酸506(TGG)，蘇氨酸514(ACC)→丙氨酸514(GCC)，絲氨酸515(AGC)→甘氨酸515(GGC)，亮氨酸Leu556(CTC)→脯氨酸556(CCC)。

2.5 綠膿桿菌ATCC9027外毒素PE40基因系統(tǒng)發(fā)育分析下載的 PE基因序列有 AE004091，AY585869，CP000438，EU595734， EU595736， FM209186， K01397， U78761 和AY820132。另在以前的研究中獲得綠膿桿菌 ATCC27853的PE40基因序列。將這10條序列及ATCC9027的PE40基因序列作為內(nèi)群，以白喉毒素為外群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示綠膿桿菌外毒素PE40基因系形成單系群。綠膿桿菌ATCC9027與ATCC27853的PE40基因處于一個(gè)分支，說明二者的親緣關(guān)系近。

圖2 p T-PE40電泳結(jié)果

圖3 p T-PE40的HindⅢ酶切結(jié)果

3 討論

綠膿桿菌能分泌多種與毒力有關(guān)的細(xì)胞外物質(zhì)，其中以外毒素A最為重要。外毒素A機(jī)制與白喉毒素有些類似，即修飾肽鏈延伸因子-2(EF-2)，使之發(fā)生ADP-核糖基化，致蛋白質(zhì)生物合成停止從而殺死細(xì)胞〔8〕。Arg276和Arg279是毒素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵性位點(diǎn)。ADP-核糖基化的關(guān)鍵位點(diǎn)有谷氨酸553、組氨酸426、組氨酸440、色氨酸466、精氨酸458、精氨酸467、酪氨酸481、精氨酸486-492，綠膿桿菌ATCC9027外毒素PE40基因的測(cè)序結(jié)果表明，以上關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸均未發(fā)生突變，產(chǎn)生變化的8個(gè)氨基酸均不是文獻(xiàn)報(bào)道中的重要活性位點(diǎn)，這些突變不會(huì)對(duì) PEA的酶活性及細(xì)胞毒性產(chǎn)生影響，因此，來自ATCC9027的PE40基因可用于構(gòu)建免疫毒素。

PE構(gòu)建的免疫毒素，已在惡性腫瘤和艾滋病的導(dǎo)向治療〔4～6，9〕中取得了巨大的成功，其中重組免疫毒素制劑 ONTAK已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，另美國(guó)國(guó)立癌癥研究所研制的新型免疫毒素BL22，在白血病臨床試驗(yàn)中顯示了“生物魔彈”的神奇威力。還可利用PE開發(fā)綠膿桿菌疫苗，其是一種很好的疫苗蛋白，不論制成無毒的PE片段或與其他抗原融合，都可以運(yùn)用到疫苗發(fā)展上。針對(duì)肝癌細(xì)胞的治療方面，利用PEA能夠攜帶蛋白質(zhì)或DNA進(jìn)入細(xì)胞中的特殊功能，可以開發(fā)出極佳的基因治療工具或蛋白質(zhì)治療藥物。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，將會(huì)有更多、效果更好的免疫毒素用于腫瘤的治療。

1 Wels W，Harwerth LM，Muller M，et al.Selective inhibition of tumor cell growth by a recombinant single-chain antibodytoxin specific for the erbB-2 receptor〔J〕.Cancer Res，1992;52(22):6310-7.

2 Kreitman RJ，Wilson WH，Bergeron K，et al.Efficacy of the anti-CD22 recombinant immunotoxin BL22 in chemotherapy resistant hairy-cell leukemia〔J〕.N Engl J Med，2002;345(4):241-7.

3 Hwang J，F(xiàn)itzgerald DJ，Adhya S，et al.Functional domains of Pseudomonas exotoxin identified by deletion analysis of the gene expressed in E.col〔iJ〕.Cell，1987;48(1):129-36.

4 Posey JA，Khazaeli MB，Bookman MA，et al.A phaseⅠ trial of the single-chain immunotoxin SGN-10(BR96 sFv-PE40)in patients with advanced solid tumors〔J〕.Clin Cancer Res，2002;8(10):3092-9.

5 賈 怡，李 虹，陳文捷，等.新型重組免疫毒素DT390-mRantes治療小鼠EAE的初步研究〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007;23(3):236-9.

6 IL-10(18-57)-PE40高效表達(dá)、純化及細(xì)胞活性之研究〔J〕.生物工程學(xué)報(bào)，2006;22(1):87-93.

7 Gray GL，Smith DH，Baldridge JS，et al.Cloning，nucleotide sequence，and expression in Escherichia coli of the exotoxin A structural gene of Pseudomonas aeruginosa〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1984;81(9):2645-9.

8 Iglewski BH，Kabat D.NAD-dependent inhibition of protein synthesis by Pseudomonas aeruginosa toxin〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1975;72(6):2284-8.

9 Foss FM，Bacha P，Osann KE，et al.Biological correlates of acute hypersensitivity events with DAB(389)IL-2(denileukin diftitox，ONTAK)in cutaneous T-cell lymphoma:decreased frequency and severity with steroid premedication〔J〕.Clin Lymphoma，2001;1(4):298-302.