孔令環(huán)，韓 梅，肖中平，陳 琳

（吉林省人民醫(yī)院 血液風(fēng)濕科，吉林 長(zhǎng)春130021）

利用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）對(duì)白血病病人進(jìn)行免疫分型和微小殘留病檢測(cè)的應(yīng)用越來越廣泛，其中AML伴淋系交叉表達(dá)者有獨(dú)特的生物學(xué)特點(diǎn)。本文總結(jié)我院86例急性髓系白血病病人的臨床資料，探討伴CD7、CD56、CD19表達(dá)的AML病例的臨床特點(diǎn)、預(yù)后以及在微小殘留?。∕RD）監(jiān)測(cè)中的意義。

1 材料

1.1 臨床資料

選擇2008年1月至2012年1月初治急性髓系白血病86例，男52例，女34例，年齡10－80歲。按FAB分型，M11例，M233例，M318例，M414例，M518例，M72例。以上病例根據(jù)FAB分型、免疫學(xué)分型及遺傳學(xué)分析均符合診斷。

1.2 主要試劑

抗體：購(gòu)自法國(guó)Immunotech公司。20種四色熒光（PE、FITC、ECD、PE－CY5）標(biāo)記的單抗如下：髓系：CD33、CD117、CD13、CD14、CD15、cMPO、CD11b；T 淋系：cCD3、CD5、CD7；B 淋系：CD10、CD19、CD20、CD23、cCD79a；NK 細(xì)胞：CD56；非特異性早期標(biāo)志：CD34、HLA－DR、CD38和CD45。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)本的采集

取白血病病人骨髓為標(biāo)本，涂片6－8張作為形態(tài)學(xué)分析，同時(shí)采集6ml骨髓用肝素抗凝，并在2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)數(shù)據(jù)采集；并送染色體、融合基因檢測(cè)。

2.2 標(biāo)本的標(biāo)記

利用四色熒光（PE、FITC、ECD、PE－CY5）直接標(biāo)記法標(biāo)記。每個(gè)試管分別加入待測(cè)熒光標(biāo)記抗體20μl、骨髓細(xì)胞懸液100μl，混勻。室溫遮光孵育15min，加入溶血?jiǎng)┗靹?，避?0min，加入PBS洗滌，以1 500rpm／min離心5分鐘，棄上清，即可上機(jī)檢測(cè)。

2.3 流式細(xì)胞儀分析

采用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司EPICS－XL型流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)，激光波長(zhǎng)為488nm，EXP3.2V1.2B軟件程序?qū)Λ@得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重設(shè)門顏色示蹤法分析。免疫分型以CD45／SSC設(shè)門，收集20000個(gè)細(xì)胞檢測(cè)。分析時(shí)以幼稚細(xì)胞群中抗原表達(dá)細(xì)胞大于20%作為陽(yáng)性。

2.4 MRD分析

采 用 CD45CD34CD33CD7、CD45CD34CD13CD7、CD45CD34CD33CD56、CD45CD34CD13CD56、CD45CD34 CD13CD19、CD45CD34CD33CD19六種抗體組合方案進(jìn)行MRD監(jiān)測(cè)。正常對(duì)照及MRD檢測(cè)收集500000個(gè)細(xì)胞。如果在篩選時(shí)白血病細(xì)胞出現(xiàn)的區(qū)域有細(xì)胞存在，以這些殘存的細(xì)胞占骨髓單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)的比例作為MRD值。多個(gè)抗體組合以數(shù)值最大者為MRD值。參考值以 MRD≥10－4為陽(yáng)性，MRD＜10－4為陰性。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 交叉表達(dá)CD抗原在AML各亞型中的表達(dá)

見表1。

表1 86例AML患者CD抗原交叉表達(dá)情況

Ly＋－AML占 AML（非 M3）47.1%；Ly＋－AML常見表達(dá)CD56、CD7、CD19，其出現(xiàn)頻率在 M2、M4、M5亞型中分別為48.5%、21.4%、55.6%；M3型僅1例交叉表達(dá)CD56；在非M3髓系白血病中CD7占22.1%，CD56占17.6%，CD19占7.4%；CD56在M2中表達(dá)最高占21.2%，CD7在M5中表達(dá)最高占33.3%；CD19在各亞型中表達(dá)均低。

3.2 交叉免疫表型與治療效果的關(guān)系

68例非M3髓系白血病首次化療形態(tài)學(xué)完全緩解率為76.5%（52／68），首次化療未達(dá)CR者16例，其中14例有交叉免疫標(biāo)記，其中6例伴CD56陽(yáng)性、6例伴CD7陽(yáng)性、2例CD19陽(yáng)性。首次化療形態(tài)學(xué)CR率Ly＋－AML 56.3%（18／32）低于Ly－－AML 88.9%（32／36），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。生存期低于2年者43例，其中28例AML伴淋系交叉表達(dá)，2年死亡率 Ly＋－AML87.5%（28／32）高于 Ly－－AML41.7% （15／36），差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 （P＜0.05）。

3.3 與MRD的關(guān)系

68例（非 M3）AML 分成4組：CD7＋AML，CD56＋AML，CD19＋AML，Ly－－AML。觀察與首次誘導(dǎo)治療后MRD陽(yáng)性表達(dá)之間的關(guān)系（見表2）。

表2 68例AML與首次誘導(dǎo)治療后MRD陽(yáng)性表達(dá)之間的關(guān)系（χ2 檢驗(yàn)）

在 MRD陽(yáng)性檢出率方面，CD7＋AML組與Ly－－AML組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1＜0.05），CD56＋AML組與Ly－－AML組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P2＜0.05），CD19＋AML組與Ly－－AML組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P3＞0.05）。

4 討論

髓系白血病伴淋系交叉表達(dá)現(xiàn)象很普遍，本研究中47.1%的AML（非M3）初發(fā)時(shí)存在跨系列異常免疫表型，常見交叉表達(dá)CD7、CD56、CD19，出現(xiàn)頻率 在 AML 亞 型 中 依 次 為 M5（55.6%）、M2（48.5%）、M4（21.4%），由于交叉表達(dá)現(xiàn)象在 AML各亞型的分布不同，其化療效果及預(yù)后也不同。

CD56分子屬于超免疫球蛋白家族的成員，是神經(jīng)細(xì)胞黏附分子的異構(gòu)體和自然殺傷淋巴細(xì)胞（NK）的標(biāo)志，使腫瘤細(xì)胞易于浸潤(rùn)。有報(bào)道［1］，CD56表達(dá)與多藥耐藥蛋白P170高表達(dá)呈正相關(guān)，主要表現(xiàn)為髓外浸潤(rùn)和復(fù)發(fā)。

CD7抗原分子量為40kDa的單鏈糖蛋白，主要表達(dá)在所有胸腺細(xì)胞、大部分外周血T淋巴白血病細(xì)胞，CD7被認(rèn)為是T淋巴細(xì)胞的特異性標(biāo)志抗原。后來的研究認(rèn)為CD7在髓系白血病的表達(dá)，可能是一種白血病干細(xì)胞標(biāo)志［2，3］。

本組68例 AML（非 M3）中交叉表達(dá)CD7、CD56 、CD19 的 百 分 率 分 別 為 22.1%、17.6%、7.4%；CD7表達(dá)最高，與馬云等報(bào)道［4，5］一致。本組病人首次化療未達(dá)形態(tài)學(xué)CR者共16例，其中6例伴CD56陽(yáng)性、6例伴CD7陽(yáng)性；本組僅見1例M7同時(shí)表達(dá)CD7CD56，未緩解，放棄治療；1例M1表達(dá)CD7，放棄治療；32例Ly＋－AML病例中生存期大于2年的僅有4例；有資料報(bào)道［6－9］AML免疫標(biāo)記中伴淋系抗原CD7、CD56陽(yáng)性被認(rèn)為是預(yù)后不良的免疫表型，與本組試驗(yàn)結(jié)果一致。另外還發(fā)現(xiàn)Ly＋－AML中 M5型最多（55.6%），其中CD7在 M5中也表達(dá)最高，因此M5預(yù)后最差，與臨床表現(xiàn)相符。資料中18例M3僅見1例有交叉表達(dá)，表達(dá)CD56且同時(shí)表達(dá)CD34，病人未緩解，1個(gè)月內(nèi)死亡；其他17例M3型CD34和CD7均呈陰性表達(dá)，治療效果好，其微小殘留病監(jiān)測(cè)全部采用FISH查融合基因。

CD19是B淋巴細(xì)胞特異性標(biāo)記，據(jù)報(bào)道［10］，CD19在正常造血干細(xì)胞、漿細(xì)胞、T細(xì)胞及其他組織中沒有表達(dá)，而在B－ALL及非何杰金氏淋巴瘤中高表達(dá)，是B－ALL和B系淋巴瘤的理想治療靶點(diǎn)。本組發(fā)現(xiàn)CD19在AML各亞型中表達(dá)均低于10%；在MRD陽(yáng)性檢出率方面，CD19＋AML組與Ly－－AML組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P3＞0.05），所以，CD19在MRD監(jiān)測(cè)中的意義有待進(jìn)一步觀察。

本組共68例AML利用FCM做了MRD檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在 MRD陽(yáng)性檢出率方面，CD7＋AML組與Ly－－AML組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1＜0.05），CD56＋AML組與Ly－－AML組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P2＜0.05），即CD7＋AML病例或 CD56＋AML病例首次化療后的MRD值多數(shù)大于10－4，證明伴CD7或CD56表達(dá)的AML病人對(duì)化療藥物不敏感，病人首次化療后殘留的白血病細(xì)胞數(shù)高，MRD檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，預(yù)后不良。另一方面，可以選擇CD7或CD56作為特異性標(biāo)記進(jìn)行MRD監(jiān)測(cè)。當(dāng)遇到不是初治病例或沒有免疫分型的病例時(shí)，由于CD56在M2中表達(dá)最高，因此做MRD監(jiān)測(cè)時(shí)M2型選擇CD45CD34CD13CD56，CD45CD34CD33CD56；CD7在M5型表達(dá)高，因此在M5型監(jiān)測(cè) MRD時(shí)選擇CD7，組成四色抗體組合動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)MRD。

急性白血病跨系異常表達(dá)反映了白血病細(xì)胞的發(fā)育和分化異常，是白血病相關(guān)免疫表型，為白血病的預(yù)后判斷提供了依據(jù)，也為臨床靶向性藥物的治療提供了直接證據(jù)。因此，當(dāng)AML病人免疫分型出現(xiàn)交叉表達(dá)CD56、CD7時(shí)，提示臨床應(yīng)調(diào)整化療方案，強(qiáng)調(diào)個(gè)體化治療，并選擇特異性強(qiáng)的四色抗體組合進(jìn)行MRD監(jiān)測(cè)。

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