王玲玲，高 申，孫 莉，趙海豐，宋麗娜，師慶紅，王 海，郭宏華，何成彥

（1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.吉林大學第二臨床學院，吉林 長春130041；3.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院）

大腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，是多種致癌因素共同作用發(fā)生的惡性病變。在全世界范圍內(nèi)，大腸癌是第三大惡性腫瘤，其病死率占全部癌癥的第二位［1］。大腸癌的發(fā)生發(fā)展與基因的異常表達密切相關(guān)，涉及ras、myc等原癌基因的激活和APC、MCC、P53、P73等抑癌基因的失活。隨著分子生物學的快速發(fā)展，關(guān)于大腸癌發(fā)生發(fā)展的機制和腫瘤標記物的研究進展迅速。本研究針對大腸癌組織、癌旁組織和健康對照三組樣本，選取MCC、Survivin、P73和RhoA等四種基因進行檢測，探討以上指標與大腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為大腸癌發(fā)病機制的研究提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 對象 選取吉林大學第二醫(yī)院就診的大腸癌患者癌組織和癌旁10cm以外的正常組織作為檢測對象，癌組織均經(jīng)病理檢查證實為Dukes A期；對照組為20例取自因腹部外傷時的健康人的正常結(jié)腸組織。所有病例均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審校批準。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 取100mg組織樣品，加入1 ml的TRIZOL試劑，勻漿。勻漿后樣品于15－30℃孵育5min，加入0.2ml的氯仿，振蕩15秒，15－30℃孵育2－3min；4℃，12 000r／min離心15分鐘。RNA沉淀：將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中，加入0.5ml的異丙醇，混勻后15－30℃孵育10min；4℃，12 000 r／min離心10min。移去上清液，加入1ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀，振蕩；4℃，7 500r／min離心5分鐘。在空氣中干燥RNA沉淀5－10min。加入無RNA酶的水，反復吹打幾次，55－60℃孵育10 min，獲得的RNA溶液保存于－70℃。

1.2.2 RNA質(zhì)量檢測 采用變性瓊脂糖凝膠電泳來觀察RNA的質(zhì)量。其具體步驟如下：將1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60°C，加入10ml的10×MOPS電泳緩沖液和18ml 37% 甲醛溶液；灌制凝膠板，膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的MOPS電泳緩沖液；取5μl RNA，加等體積的2×甲醛上樣染液，再加入少量EB；上樣，在5–6V／cm電壓下電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2－3 cm；紫外透射光下觀察并拍照，28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃，上面一條帶的亮度大約是下面一條帶的2倍。

1.2.3 cDNA合成 按以下條件配制反應液：buffer 2μl，上游引物（TAKARA公司設計）0.2μl，下游引物（TAKARA 公司設計）0.2μl，dNTP 0.1 μl，逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 MMLV（TAKARA 公 司）0.5μl，DEPC水5μl，RNA模版2μl，混勻，6 000rpm 瞬時離心?；旌弦涸诩尤肽孓D(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘；取出后立即95℃干浴3分鐘，得到cDNA溶液，保存于－80℃待用。

1.2.4 實時熒光定量 PCR SYBR Green 1染料（TAKARA公司）10μl，上游引物F 0.5μl，下游引物R 0.5μl，dNTP 0.5μl，Taq酶1μl，模板DNA 5 μl，ddH2O 32.5μl，總體積 50μl；混勻，6 000rpm瞬時離心，于Real time PCR儀上進行擴增反應。反應程序設定：第一步：93℃2min，第二步：93℃1 min，55℃ 1min，72℃ 1min，40個循環(huán)，第三步：72℃7min。PCR反應完后，取PCR產(chǎn)物跑2%瓊脂糖凝膠電泳，并加DNA Ladder作為參考，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶；用軟件分析數(shù)據(jù)，記錄反應體系中熒光信號的強度CT值，以GAPDH為內(nèi)參，2－△△CT法計算各基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 MCC、Survivin、P73、RhoA和內(nèi)參基因引物序列

1.3 統(tǒng)計學分析 每組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x—±s）表示，將P＜0.05設為顯著性差異的標準。采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

MCC、Survivin、P73和RhoA在大腸癌組織中的表達均顯著高于癌旁組織和健康人結(jié)腸組織（P＜0.01），而在癌旁和健康對照組中表達變化不大；4種基因在癌組織、癌旁組織和健康對照組中的表達情況見圖1。

圖1 Real time PCR檢測 MCC、Survivin、P73和RhoA在大腸癌中的表達

3 討論

MCC基因編碼829個氨基酸，是1991年由Kinzler等人發(fā)現(xiàn)的，其與早期直結(jié)腸癌有密切關(guān)系。Fukuyama等［2］在研究鋸齒狀結(jié)腸癌時，發(fā)現(xiàn)MCC可能是一個潛在的腫瘤抑制因子，它可以抑制Wnt／β－連鎖蛋白信號轉(zhuǎn)導通路。近年來，關(guān)于MCC突變的研究較多，其突變發(fā)生于大腸癌早期［3］；有學者發(fā)現(xiàn)，MCC基因在大腸癌及癌旁組織的突變率與正常組織差異有統(tǒng)計學意義，而癌組織與癌旁之間差異無顯著性［4］。本研究顯示，MCC在大腸癌組織中的表達顯著高于癌旁及健康對照組，而癌旁與健康對照之間表達無統(tǒng)計學意義。根據(jù)MCC突變及表達情況，我們可以了解到其在大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Surivin基因長度14.5kb，含有4個外顯子、3個內(nèi)含子；Surivin是凋亡抑制蛋白家族成員之一，可以抑制細胞凋亡、促進腫瘤增殖、誘導血管生成。Surivin分布具有組織特異性，在正常成人組織的表達僅見于胸腺、睪丸和分泌期的子宮內(nèi)膜；在大多數(shù)腫瘤組織中有高表達，包括肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、骨肉瘤和淋巴瘤［5］。Survivin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望成為腫瘤治療的新靶點［6］。P73基因是Kaghad等在1997年發(fā)現(xiàn)的，定位于1p36.2－36.3，與P53在結(jié)構(gòu)和功能上有相似性。P73過表達能夠激活P53的靶基因，可以誘導細胞凋亡［7］。P73高表達預示臨床預后較差，提示其在腫瘤發(fā)生過程中起到促進腫瘤進展的作用。Rho家族主要包括 Rho（A、B、C）、Rac和cdc42三個亞家族，其中RhoA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。有學者對小鼠骨癌模型進行研究時發(fā)現(xiàn)，RhoA參與癌性骨痛的發(fā)展過程［8］。還有學者研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者體內(nèi)RhoA不僅表達高，而且與埃茲蛋白的表達機制有關(guān)，為腫瘤的治療提供了新的靶點［9］。

本研究結(jié)果顯示，MCC、Survivin、P73和RhoA在癌組織高表達，表明它們在大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。隨著分子生物學技術(shù)的迅猛發(fā)展，相信我們會對越來越多的基因促進大腸癌發(fā)生發(fā)展的機制有更深一步的了解，從而為大腸癌發(fā)病機制和基因干預治療的進一步研究奠定理論依據(jù)和實驗基礎。

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