唐 毅，李辛平，唐振勇，劉麗麗，唐耘天＊

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院本碩062班，廣西 南寧530021；2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 肝膽外科，廣西 南寧530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院本碩074班 ，廣西 南寧530021）

原發(fā)性肝癌（primary hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，預(yù)后差。我國是肝癌大國，全球50%以上的肝癌病例發(fā)生在我國，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢［1］。但迄今為止，其確切的發(fā)病機(jī)制尚未明了。有研究顯示：DNA氧化損傷的主要產(chǎn)物8－羥基脫氧鳥苷（8－OHdG）在體內(nèi)的長期積累會(huì)增加自發(fā)性突變率，與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)聯(lián)［2］。本研究通過ELISA檢測法測定肝癌患者的尿8－OHdG水平，并與健康體檢者進(jìn)行比較，以探討氧化損傷在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)組：選擇廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院肝膽外科2011年8月至2012年10月期間收治的男性肝癌患者100例，年齡21－74歲，平均年齡為49.24±10.36歲。所有患者無嚴(yán)重心、肺和腎等重要臟器的急慢性疾病史，均經(jīng)過術(shù)后病理學(xué)檢查或經(jīng)皮穿刺活檢確診為原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌；對(duì)照組：該院門診男性健康體檢者100例，年齡25－65歲，平均年齡為48.60±9.93歲。兩組研究對(duì)象的一般資料經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，無明顯差異。

1.2 標(biāo)本采集 采集肝癌患者以及健康體檢者清晨中段尿，留取量各約10ml。標(biāo)本不加任何防腐劑，采集后立即轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱中冷凍保存待用。

1.3 主要試劑和儀器 人8－OHdG單克隆抗體試劑盒以及人肌酐ELISA試劑盒均由BlueGene Biotech公司提供，主要儀器為酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀（型號(hào)GF－M3000，購于山東高密彩虹分析儀器有限公司）。

1.4 尿8－OHdG檢測方法 將尿樣室溫解凍，震蕩混勻后離心15min（3 000r／min），取上清100μl。以ELISA法嚴(yán)格按試劑盒說明書操作檢測尿8－OHdG。由于尿中的8－OHdG受尿濃縮程度的影響，最終數(shù)值采用尿肌酐（creatine，Cr）值較正，單位為（8－OHdG）ng／mgCr。尿肌酐亦采用 ELISA 法檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，各項(xiàng)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，肝癌組與實(shí)驗(yàn)組間相對(duì)表達(dá)水平的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 8－OHdG標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取8－OHdG標(biāo)準(zhǔn)液（0、10、25、50、100、250ng／mL）和空白對(duì)照（蒸餾水），采用相同測定方法用酶標(biāo)儀測定光吸收值。以450nm下吸光度值為縱坐標(biāo)，以8－OHdG含量（ng／ml）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 ELISA方法測定8－OHdG含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 尿8－OHdG的檢測 根據(jù)各尿樣本在450nm下的吸光度值，結(jié)合8－OHdG含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算肝癌患者（HCC）和健康對(duì)照組尿8－OHdG的含量。經(jīng)t檢驗(yàn)，肝癌患者和健康體檢者兩組人群尿8－OHdG水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 肝癌患者和健康體檢者尿8－OHdG水平的比較

3 討論

8－OHdG 是活性自由基（reactive oxygen species，ROS）攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子而產(chǎn)生的一種氧化性加合物，由于其為代謝終產(chǎn)物，具有形成途經(jīng)單一、在體內(nèi)穩(wěn)定、易于檢測等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為評(píng)價(jià)機(jī)體內(nèi)DNA氧化損傷水平的最常用的生物標(biāo)志物。8－OHdG產(chǎn)生后無需進(jìn)一步代謝而經(jīng)腎臟排泄，其在尿中的含量不受飲食等因素影響，因此尿8－OHdG的含量可以反映機(jī)體氧化損傷的程度。既往研究證實(shí)，8－OHdG具有突變性，可以在DNA復(fù)制時(shí)引起G：C→T：A的顛換而導(dǎo)致點(diǎn)突變［3］。8－OHdG異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并且與很多惡性腫瘤的預(yù)后有相關(guān)性［4－8］。肝癌是常見的惡性腫瘤，其確切發(fā)病機(jī)制目前尚未被闡明。肝炎病毒感染、黃曲霉毒素污染、飲酒等暴露是肝癌發(fā)病的高危因素，其可引起肝細(xì)胞DNA氧化損傷，使損傷累積導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，并被認(rèn)為此為肝癌的發(fā)病重要機(jī)制［9］。

研究表明，體內(nèi)8－OHdG水平與年齡、性別、吸煙、劇烈運(yùn)動(dòng)、職業(yè)暴露、輻射以及糖尿病、腫瘤、心血管疾病等多因素有關(guān)［10－15］。本研究對(duì)象入組時(shí)嚴(yán)格排除了上述因素的影響，通過ELISA法檢測肝癌患者尿8－OHdG的含量以研究DNA氧化損傷與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。具有：標(biāo)本采集簡單、無創(chuàng)傷、易于保存、檢測指標(biāo)穩(wěn)定性強(qiáng)；檢測方法對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的要求低；所需時(shí)間少、試樣的制備簡單、分析所需樣品量少等諸多優(yōu)點(diǎn)［16］?？勺鳛橐环N大量人群中的肝癌普查篩查工具，該方法具有推廣的可能性。

本研究結(jié)果顯示：健康體檢者尿8－OHdG的含量為12.21±4.51ng／mgCr，與其他研究結(jié)果接近［11，17，18］。肝癌患者尿8－OHdG的含量為16.12±5.30ng／mgCr，顯著高于健康體檢者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），這與已有的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)結(jié)果相一致［17］。故本研究的結(jié)論為，DNA氧化損傷水平與肝癌的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系，測定尿8－OHdG的含量有助于肝癌的早期診斷，該方法有望成為肝癌篩查與診斷的新工具。

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