孫紅村 郭明麗 王俊閣 張建耀

研究［1-2］證實，體內絕大多數腫瘤組織中都有信號轉導及轉錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)的異?；罨缰袠猩窠浵到y腫瘤、呼吸道腫瘤、消化道腫瘤、乳腺癌、黑色素瘤、皮膚癌及頭頸部腫瘤等。由于細胞外的配體與細胞表面的受體結合，STAT3信號轉導通路得以激活，進而調控腫瘤的增殖和侵襲［3］。實驗［4］發(fā)現，STAT3 在喉癌中的表達與臨床分期、分級及淋巴結轉移有明顯關系。前期實驗我們成功篩選出了穩(wěn)定表達siRNA-STAT3的Hep-2細胞系［5］。本實驗在此基礎上將觀察STAT3被抑制后Hep-2細胞侵襲性的變化及下游細胞外基質黏附分子-1(intercelluar adhesion molecule 1，ICAM-1)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的表達，探討其可能的侵襲機制，為臨床通過基因沉默技術治療喉癌提供實驗支持和理論依據。

1 資料與方法

1.1 材料及儀器 喉鱗癌細胞系Hep-2(美國國家癌癥研究所病理實驗室提供，白求恩國際和平醫(yī)院保存)，RPMI 1640培養(yǎng)基 (Gibco公司，美國)，HRP-山羊抗鼠 IgG和 ICAM-1、VEGF鼠抗人單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)，細胞培養(yǎng)板(Costar公司，美國)，Matrigel膠(B.D.公司，美國)，Transwell小室(Corning公司，美國)，光學顯微鏡(Olympus公司，日本)，Leica B6120溫箱(Heraeus公司，德國)，熒光倒置顯微鏡(Leica公司，德國)。STAT3(2144-2162)正義鏈序列為5'-CACCGCAGCAGCTGAACAACATGTTCA AGAGACATGTTGTTCAGCTGCTGCTTTTTTG-3'，反 義鏈5'-GATCCAAAAAAGCAGCAGCTGAACAACATGTCT CTTGAACATGTTGTTCAGCTGCTGC-3'。同時設陰性對照 shNC，其序列如下:正義鏈 5'-CACCGTT CTCCGAACGTTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTT CGGAGAATTTTTTG-3'，反 義 鏈 5-GATCCAAAAAAT TCTCCGAACGTGTCCGTAATCTCTTGACGTGACACGTT CGGAGAAC-3'。

1.2 研究分組 研究分為3組:①空白對照組;②重組siRNA-STAT3質粒組;③重組siRNA-shNC組(無關質粒)。

1.3 細胞黏附實驗 用無血清RPMI1640培養(yǎng)基按3∶1比例稀釋Matrigel膠。96孔培養(yǎng)板中加入Matrigel膠稀釋液及細胞。先行MTT比色法檢測黏附細胞吸光值:37℃孵育20、40、60min后，吸出未黏附細胞，每孔添加新鮮培養(yǎng)基及MTT液(5mg/mL)及DMSO。測定各孔細胞在490 nm波長處的吸光值(A值)。檢測總細胞吸光值:各組細胞37℃孵育4 h后，每孔直接添加等量MTT，余同前操作。細胞黏附率(%)=(黏附細胞A值/總細胞A值)×100%。

1.4 細胞遷移實驗 接種細胞于96孔板中培養(yǎng)24 h。用移液器槍頭(10 μL)沿培養(yǎng)孔底部呈“│”形劃痕;用無血清培養(yǎng)液洗滌，更換含1%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再換用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。觀察劃痕區(qū)細胞遷移情況并照相。

1.5 細胞侵襲實驗 稀釋Matrigel膠(1∶3)。Transwell上室加入細胞和無血清RPMI1640培養(yǎng)基，下室加入含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。取出上室，擦去Matrigel凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞。甲醇固定，行蘇木精染色。取下聚碳酯膜，將有細胞的一面置于載玻片上，高倍鏡下(×200)觀察視野內的細胞數。

1.6 Western印跡法檢測ICAM-1和VEGF蛋白的表達 提取細胞總蛋白。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。轉膜時，設置 ICAM-1和VEGF抗體轉膜條件為350 mA，1.5 h。分別加入ICAM-1和VEGF抗體及HRP標記的二抗，最后顯影及定影。

1.7 統計學處理 所有數據經Excel軟件整理，應用SPSS 11.0軟件處理數據，計量資料采用均數±標準差表示;3組均數的比較用ANVOA方差分析;組間比較和兩因素比較采用t檢驗;P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測各組細胞的黏附能力 應用MTT測定細胞在Matrigel基質上的黏附性呈現一定的時間-效應關系:接種細胞20min后觀察各組細胞的黏附率相差不大(P＞0.05)，40min后 siRNA-STAT3組的黏附率小于 siRNA-shNC組和空白對照組(P＜0.05)，STAT3被抑制后黏附抑制效應在60min后更加明顯(P ＜0.05)(表 1)。

表1 各組細胞在Matrigel基質上的黏附率()

表1 各組細胞在Matrigel基質上的黏附率()

細胞接種時間(min)n 黏附率(%)siRNA-STAT3 siRNA-shNC F值 P值空白組20 5 49.62 ±3.84 50.58 ±3.38 51.06 ±3.87 0.124 0.88640 5 75.90 ±2.20 83.06 ±5.51 86.96 ±5.04 8.063 0.02060 5 82.38 ±1.76 93.60 ±1.93 93.94 ±2.35 12.5270.012

2.2 細胞劃痕法檢測各組細胞的遷移能力 接種培養(yǎng)板48 h后，熒光顯微鏡下見空白組和siRNA-shNC組的Hep-2細胞向劃痕區(qū)生長速度明顯快于siRNASTAT3組，而空白組和siRNA-shNC組的Hep-2細胞向劃痕區(qū)生長速度基本一致(圖1)。

2.3 Transwell法檢測各組細胞的侵襲能力 以細胞穿過Matrigel基質的能力量化其侵襲能力。本實驗各組細胞接種Transwell小室24 h后，siRNA-STAT3組穿至濾膜下面的細胞數明顯低于空白對照組和siRNA-shNC組(圖2)。

圖1.接種培養(yǎng)板48 h后各組細胞的遷移變化(10×20)

圖2.穩(wěn)定轉染siRNA-STAT3對Hep-2侵襲能力的影響(蘇木精染色，10×20)

2.4 Western印跡 結果顯示，siRNA-STAT3組VEGF和ICAM-1蛋白的表達量均低于空白組和siRNA-shNC組(圖3)。

圖3.ICAM-1，VEGF表達量的變化

3 討論

侵襲和轉移是惡性腫瘤的特性之一，也是目前治療效果較差的原因之一。STAT3信號傳導通路參與腫瘤的侵襲及轉移。人類黑色素瘤中STAT3的異常表達能顯著提高癌細胞腦轉移的機會［6］，說明活化的STAT3對腫瘤的侵襲及轉移起著重要作用。Dien等［7］證實了p-STAT3在有局部淋巴結轉移的乳腺癌中存在高表達，提示STAT3的異常激活可能與乳腺癌的細胞侵襲性有關。有實驗［4］表明，STAT3與喉癌的侵襲也呈正相關。

腫瘤細胞與細胞外基質黏附在其侵襲和轉移過程中起著極為重要的作用。由于Matrigel膠經重建后能在聚碳酸濾膜表面形成類似天然基底膜的結構，借助Matrigel膠通過 MTT法觀察黏附的細胞數能模擬Hep-2細胞的黏附能力。本實驗發(fā)現，隨著接種培養(yǎng)板的時間延長，siRNA-STAT3組Hep-2細胞與細胞外基質黏附率逐漸下降。說明STAT3基因表達被沉默后，Hep-2細胞在人工基質上的黏附力下降，提示STAT3基因能夠釋放出某種信號，以增加相關黏附蛋白的表達，使喉癌細胞群擴散，并不斷與細胞外基質接觸和黏附，進而打開侵襲的大門。ICAM-1作為黏附蛋白已被證實在腫瘤中存在著高表達，其作用與腫瘤細胞的黏附和遷移明顯相關［8-9］。而且本實驗在穩(wěn)定轉染siRNA-STAT3的細胞中檢測到ICAM-1的表達下降，說明ICAM-1在喉癌細胞黏附細胞外基質中起著重要作用。另外，ICAM-1高表達的細胞更易出現血行轉移，這是因為ICAM-1能使已入血的腫瘤細胞順利黏附到血管內皮細胞上［10］。

由于喉癌侵襲以局部浸潤為主，所以需具備一定的運動能力，才能到達相鄰正常組織。為了證實STAT3信號通路與喉癌Hep-2細胞的遷移關系，通過劃痕實驗發(fā)現接種培養(yǎng)板48 h后，siRNA-STAT3組的Hep-2細胞向劃痕區(qū)生長速度明顯落后于空白對照組和shNC組，表明激活的STAT3能增強Hep-2細胞的運動能力。由于喉癌細胞遷移伴隨著侵襲的整個過程，整個遷移過程中STAT3信號通路到底發(fā)揮多大作用也決定著喉癌的侵襲能力。腫瘤的遷移模式分為阿米巴式遷移和間充質式遷移。當上皮細胞可塑性變化時，這兩種模式可相互轉變［11］。

喉癌侵襲和轉移最關鍵的一步就是黏附并降解細胞外基質(extracellular matrix，ECM)。ECM包括膠原、纖黏蛋白及層黏蛋白等。腫瘤細胞從原發(fā)部位脫落后，入侵到ECM，與基底膜和細胞間質中一些分子黏附，通過分泌各種降解酶，協助腫瘤細胞穿過ECM進入血管。Transwell小室和Matrigel膠可以模擬細胞外基質的結構。我們在實驗中觀察到，STAT3干擾組穿過基質和濾膜喉癌Hep-2細胞數明顯低于其他兩組，說明STAT3的表達被抑制后，Hep-2細胞侵襲能力下降，提示STAT3信號通路能增強喉癌細胞降解基質的能力來增強其侵襲性，以便其能更好地向周圍正常組織擴散和生長。

癌細胞的血管生成作用作為侵襲的終末環(huán)節(jié)，能體現惡性腫瘤的侵襲力，其中VEGF蛋白的表達對腫瘤侵襲的影響至關重要。由于它能顯著促進原發(fā)瘤的生長和轉移，故其生物學特征影響著腫瘤發(fā)生、轉移及預后［12］。本實驗觀察到STAT3表達被抑制后 VEGF的表達明顯下降，推測Hep-2細胞侵襲力的下降與VEGF表達下降有關。

喉癌Hep-2細胞的黏附、遷移、降解基質及血管生成作用的能力均伴隨著侵襲的整個過程，各個環(huán)節(jié)又相互作用，相互影響。STAT3信號通路的激活能夠影響喉癌的侵襲和轉移，從根本上說與相關蛋白的活性增強或表達增加有關?？偨Y本次實驗，我們認為VEGF和ICAM-1作為兩個特征性蛋白的高表達共同參與了STAT3信號通路對喉癌Hep-2細胞的調控。它們表達的高低直接影響Hep-2細胞的黏附、遷移、降解基質及血管生成的作用。

總之，我們發(fā)現STAT3能提高喉癌細胞的黏附、遷移、降解基質及血管生成能力，其機制可能與ICAM-1和VEGF的表達有關。另外本實驗也提示我們應用RNA干擾技術沉默STAT3的表達能顯著抑制喉癌細胞的侵襲性。但由于STAT3信號通路的調控非常復雜，對STAT3作用于喉癌細胞的侵襲機制的研究仍需不斷深入。

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