李綱 錢婷婷 洪佳旭 徐建江 吳繼紅 崔呈俊 莫秀梅

角膜病是我國的重要致盲性眼病。同種異體角膜移植術(shù)是目前臨床上治療角膜盲最有效的方法。但是，角膜移植的供體來源極其匱乏，而且術(shù)后經(jīng)常會發(fā)生排斥反應(yīng)、各種并發(fā)癥和潛在的疾病傳播等問題，因此嚴(yán)重限制了其在臨床上的應(yīng)用。

隨著組織工程學(xué)技術(shù)在角膜重建上的廣泛應(yīng)用，組織工程角膜成為一種極具前景的角膜替代品。其中，又以組織工程角膜上皮層的構(gòu)建發(fā)展最為迅速。構(gòu)建組織工程角膜上皮的基本方法是取少量健康組織，獲取干細(xì)胞并進(jìn)行體外擴(kuò)增后，將其接種在生物相容性良好的支架材料上，在體外形成結(jié)構(gòu)與正常角膜上皮相似的細(xì)胞材料復(fù)合物，再移植到患者的眼表。理想的支架材料是成功構(gòu)建組織工程角膜上皮的關(guān)鍵。目前，常用于組織工程角膜上皮的支架材料有羊膜、纖維蛋白膠、溫敏材料等。其中，由于羊膜具有良好的生物相容性、抑制炎癥及新生血管等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上廣泛應(yīng)用。然而，羊膜是一種同種異體的生物材料，存在著一些缺點(diǎn)，包括潛在的傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)、來源有限、特殊的保存條件等;而由天然材料和人工合成高分子材料組成的復(fù)合支架材料可以克服以上這些缺點(diǎn)。絲素蛋白(silk fibroin，SF)是蠶絲的主要成分，具有良好的生物相容性，在體內(nèi)可以被蛋白酶完全降解［1-2］。近期，有學(xué)者［3-8］研究報(bào)道，角膜上皮細(xì)胞能夠在SF支架上生長增殖。乳酸-己內(nèi)酯共聚物［poly(L-lactic acid-co-ε-caprolactone)，PLCL］是 L-乳酸和 ε-己內(nèi)酯的共聚物，具有良好的生物相容性、可降解性以及良好的力學(xué)性能，因而廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，諸如外科手術(shù)縫合線、藥物載體及組織工程支架等［9］。目前關(guān)于SF-PLCL復(fù)合材料用做構(gòu)建組織工程角膜上皮的研究報(bào)道較少。本課題組的前期研究，證實(shí)用8%的SF-PLCL共混物(質(zhì)量比25∶75)靜電紡的納米纖維支架更有利于內(nèi)皮細(xì)胞的增殖［10］。本研究擬通過利用天然材料(SF)混合人工合成高分子材料(PLCL)和靜電紡絲技術(shù)，制作出具有良好生物相容性、較好三維結(jié)構(gòu)的角膜上皮組織工程支架材料，并通過研究兔角膜緣上皮細(xì)胞在SF-PLCL納米纖維薄膜上的黏附、增殖和分化情況，探討SF-PLCL納米纖維薄膜作為組織工程角膜上皮支架材料的可行性。

1 材料與方法

1.1 再生絲素的提取 蠶繭去蛹，剪碎，放入0.5%(w/v)的碳酸鈉水溶液中100℃煮沸3次，每次30min;用蒸餾水充分沖洗脫膠的蠶絲，干燥后用三元溶劑［CaCl2∶C2H5OH∶H2O=1∶2∶8(摩爾比)］在70 ℃溶解1 h，冷卻后裝入透析袋 (250-7u，Sigma公司，美國);然后用蒸餾水透析3 d，過濾，冷凍干燥得到SF海綿。

1.2 SF-PLCL納米纖維支架的制作 將SF和PLCL(50∶50)以質(zhì)量比25∶75，以六氟異丙醇(HFIP)為溶劑，配制總濃度為8%(g/mL)的混合溶液，室溫下攪拌過夜，獲得紡絲液。將紡絲液注入2.5mL的注射器中，注射器的金屬針頭內(nèi)徑為0.21mm。紡絲參數(shù)為:電壓12 kV、給液速率1.2mL/h、接收距離12～15cm。于室溫下紡絲，獲得SF-PLCL納米纖維膜，真空干燥，進(jìn)行退火處理:-80 kPa，水蒸氣處理6 h，自然干燥。

1.3 兔角膜緣上皮細(xì)胞培養(yǎng)及接種 取雌性健康新西蘭大白兔(上海市銀根養(yǎng)兔室提供)，體質(zhì)量2.5～3 kg，以空氣栓塞法處死。無菌條件下迅速摘取眼球，用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)反復(fù)沖洗后，浸泡于含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL的PBS中10min。在超凈工作臺內(nèi)將眼球用PBS沖洗2～3次，取角膜緣環(huán)，用2.5mg/mL的DispaseⅡ(Roche，美國)4℃消化過夜;在解剖鏡下分離出上皮片，再用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA 37℃消化10min，加含10%胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)液終止消化;相對離心力為200×g離心5min，收集細(xì)胞沉淀物。用K-SFM(Invitrogen公司，美國)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以5×105細(xì)胞/mL接種于絲裂霉素處理過的3T3培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);3 d后首次換液，以后每3 d更換1次。

1.4 兔角膜緣上皮細(xì)胞接種于SF-PLCL材料 SFPLCL材料在75%乙醇中處理30min，PBS充分漂洗后，K-SFM培養(yǎng)液中浸泡過夜。取第一代兔角膜緣上皮細(xì)胞懸液(5×105細(xì)胞/cm2)接種于SF-PLCL納米纖維膜上，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換1次。

1.5 掃描電鏡 細(xì)胞材料復(fù)合物培養(yǎng)7 d后，用PBS輕輕沖洗，2%戊二醛室溫固定30min后，按以下步驟進(jìn)行處理:PBS漂洗3次，1%鋨酸固定45min，PBS漂洗3次，乙醇梯度脫水，丙酮/醋酸異戊脂(1∶1)10min，醋酸異戊脂30min，臨界點(diǎn)干燥，噴金，用掃描電鏡(JSM6390LV，JEOL公司，日本)觀察。由中國科學(xué)院上海有機(jī)研究所協(xié)助檢查。

1.6 免疫熒光 細(xì)胞材料復(fù)合物培養(yǎng)3 d后，用PBS漂洗后，4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗3次，每次5min，1%山羊血清封閉30min。再分別用小鼠抗兔K3單克隆抗體(Chemicon公司，美國)、小鼠抗兔Integrin β1單克隆抗體(Chemicon公司，美國)4℃過夜;PBS漂洗3次，每次5min;Alex Fluor 488山羊抗小鼠熒光二抗(invitrogen公司，美國)37℃作用30min，PBS漂洗3次，每次5min;PI襯染細(xì)胞核，PBS漂洗，封片后在熒光顯微鏡(DMI3000B，Leica，德國)下觀察。

1.7 細(xì)胞活力檢測 細(xì)胞材料復(fù)合物培養(yǎng)14 d，用PBS漂洗后，用含1mmol/L Calcein AM(eBioscience公司，美國)和 2.5mg/mL PI(invitrogen公司，美國)的PBS置37℃孵育15min，用激光共聚焦顯微鏡(SP5Ⅱ型，Leica，德國)觀察。

2 結(jié)果

SF-PLCL納米纖維膜的掃描電鏡(圖1)顯示納米纖維呈隨機(jī)分布，孔與孔之間互相連通，納米纖維的平均直徑是(715±186)nm。由圖2可見濕潤的 SFPLCL納米纖維膜的光學(xué)透明度與羊膜相當(dāng)。

圖1.SF-PLCL納米纖維膜掃描電鏡(×200)

圖2.SF-PLCL納米纖維膜和羊膜的光學(xué)透明度從左到右依次為羊膜和SF-PLCL納米纖維膜

原代培養(yǎng)的兔角膜緣上皮細(xì)胞通過倒置顯微鏡觀察，呈鋪路石樣形態(tài)生長，細(xì)胞體積小，核質(zhì)比高(圖3)，表明細(xì)胞生長狀態(tài)良好。掃描電鏡(圖4)觀察顯示兔角膜緣上皮細(xì)胞在SF-PLCL納米纖維膜上也呈鋪路石樣形態(tài)黏附生長，在細(xì)胞表面分布著許多微絨毛，細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密連接，說明材料具有良好的生物相容性。免疫熒光檢測顯示(圖5)，在SF-PLCL納米纖維膜上生長的兔角膜緣上皮細(xì)胞K3蛋白表達(dá)為陽性，說明細(xì)胞可以分化為成熟的角膜上皮細(xì)胞。通過細(xì)胞活力檢測(圖6)，顯示細(xì)胞在SF-PLCL納米纖維膜上均勻分布，未見明顯的死細(xì)胞(紅色熒光)，多表現(xiàn)為活細(xì)胞(綠色熒光)。利用激光共聚焦顯微鏡的三維重建技術(shù)，可以觀察到標(biāo)本的斷層(圖6)，顯示細(xì)胞在材料上呈多層，有呈上皮層化結(jié)構(gòu)的趨勢，進(jìn)一步說明材料具有良好的生物相容性。

圖3.倒置顯微鏡下原代兔角膜緣上皮細(xì)胞形態(tài)(×100，培養(yǎng)10 d后)

圖4.兔角膜緣上皮細(xì)胞在SF-PLCL納米纖維膜生長的掃描電鏡(×1500，培養(yǎng)7 d后)

圖6.兔角膜緣上皮細(xì)胞在SF-PLCL納米纖維膜上的活力檢測(×100，培養(yǎng)14 d后)

3 討論

角膜上皮重建一直是組織工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。利用具有不同性質(zhì)的復(fù)合材料構(gòu)建組織工程支架已成為一種趨勢。本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)合SF與PLCL兩種不同材料的方法，綜合兩者的優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)建出一種適合角膜上皮生長的組織工程支架材料。SF是蠶絲的主要成分，來源豐富，在臨床上用做手術(shù)縫線已使用多年。由于其具有良好的生物相容性、可降解性、良好的透氣和免疫原性低等優(yōu)異的性能，廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。近期，已有多篇文獻(xiàn)［3-8］報(bào)道證實(shí)角膜上皮細(xì)胞可以在絲素蛋白支架材料上黏附、增殖、生長。然而單一組分的SF納米纖維脆性大，柔韌性差。PLCL是L-乳酸和ε-己內(nèi)酯的共聚物，聚乳酸(PLLA)和聚ε-己內(nèi)酯(PCL)都是經(jīng)美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的生物材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。PLCL更是具有兩者的優(yōu)點(diǎn)，PLLA生物降解度速度快，PCL生物降解度慢，因此，可通過調(diào)節(jié)兩者的合成比例，以獲得適合的降解速度，最終與角膜上皮組織工程的要求相匹配。PLCL的力學(xué)性能優(yōu)良，延展率高。已有學(xué)者［11］報(bào)道角膜上皮細(xì)胞可以在PLLA混合明膠的納米纖維膜上良好生長。還有學(xué)者［12-14］報(bào)道角膜上皮細(xì)胞、結(jié)膜上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素細(xì)胞都可以在PCL支架材料上良好生長。而目前對PLCL用做組織工程角膜上皮支架的研究鮮有報(bào)道。本研究中，我們應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)，將SF與PLCL共混電紡制作出SF-PLCL共混納米纖維膜材料，作為角膜上皮組織工程的支架材料。如圖2所示，SF-PLCL納米纖維膜材料具有較好的光學(xué)透明度，與羊膜的透明度相當(dāng)。掃描電鏡(圖4)證實(shí)兔角膜緣上皮細(xì)胞在SF-PLCL納米纖維膜上生長良好。

角膜上皮基底膜是由膠原蛋白、層粘連蛋白和其他蛋白互相編織的纖維和孔隙構(gòu)成的三維網(wǎng)狀納米結(jié)構(gòu)［15］。靜電紡絲是將高分子聚合物制備成納米級纖維的有效方法。利用靜電紡絲技術(shù)電紡獲得的纖維膜纖維直徑和孔徑可以達(dá)到納米級，制備的納米纖維支架可以仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，具有高的比表面積、高的孔隙率，有利于細(xì)胞的黏附、增殖、遷移和分化。SF-PLCL納米纖維膜的掃描電鏡(圖1)，顯示納米纖維的平均直徑是(715±186)nm。，孔與孔之間互相貫通，纖維之間交錯(cuò)排列呈三維空間。兔角膜緣上皮細(xì)胞緊密地黏附在SF-PLCL納米纖維膜上(圖4)，并陽性表達(dá)成熟角膜上皮細(xì)胞的標(biāo)記蛋白K3(圖5)。同時(shí)，還觀察到有部分細(xì)胞未表達(dá)K3蛋白。由于本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞取自角膜緣的部位，有可能是未分化的干細(xì)胞及龕細(xì)胞，有待進(jìn)一步研究證明。激光共聚焦顯微鏡(圖6)顯示，角膜緣上皮細(xì)胞在材料上分布均勻，呈2～3層的多層結(jié)構(gòu)，類似于正常角膜上皮組織的層化結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果表明，SF-PLCL納米纖維膜很好地模擬了細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)角膜緣上皮細(xì)胞的分化。

在未來的研究中，我們還需要進(jìn)一步完善該組織工程角膜上皮的相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)，明確其臨床療效及安全性，為最終開發(fā)一種成熟且可靠的角膜上皮層替代物奠定更為有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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