王玉梅， 喻 悅， 李會(huì)軍

（天然藥物活性與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇南京 210009）

HPLC-ELSD法測(cè)定青葙子中青葙苷I

王玉梅， 喻 悅， 李會(huì)軍*

（天然藥物活性與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇南京 210009）

目的 建立青葙子中青葙苷I的HPLC-ELSD測(cè)定方法。方法 以Shim-pack CLC-ODS（6.0 mm×150 mm，5 μm）色譜柱為固定相，以乙腈-水 （0.1%甲酸）為流動(dòng)相，梯度洗脫，體積流量1 mL/min，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果 青葙苷I在0.4～6.4 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值與峰面積的對(duì)數(shù)值之間有良好的線(xiàn)性關(guān)系 （Y=1.045 5X+7.278 5，r2=0.999 4），平均回收率為98.7%，RSD為2.6%（n=9）；測(cè)得10批青葙子藥材中青葙苷I的量為0.166 7%～0.313 2%。結(jié)論 所建立的HPLC-ELSD測(cè)定方法靈敏度高，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于青葙子質(zhì)量控制。

青葙子；高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法；青葙苷I

青葙子為莧科Amaranthaceae一年生草本植物 青葙Celosia argentea L.的干燥成熟種子，具清肝、明目，退翳之功效［1］。研究［2-7］發(fā)現(xiàn)青葙子所含的三萜皂苷類(lèi)成分青葙苷A ～G（celosin A ～G）、雞冠花苷 （cristatain）等具有保肝、抗腫瘤等藥理活性，是青葙子的主要藥效成分。文獻(xiàn)［8］曾采用高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法 （HPLC-ELSD）測(cè)定了青葙子中青葙苷A和青葙苷B的量。

2010年版《中國(guó)藥典》收載的青葙子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，尚缺少【含量測(cè)定】項(xiàng)。為提高青葙子質(zhì)量控制水平，本課題組對(duì)青葙子進(jìn)行化學(xué)成分研究，發(fā)現(xiàn)青葙苷I（celosin I）是青葙子中主要的皂苷類(lèi)成分 （相關(guān)研究結(jié)果另文發(fā)表）。在此基礎(chǔ)上，本研究建立了青葙子中青葙苷 I的 HPLCELSD定量測(cè)定方法，以期為青葙子的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司，包括G1311A二元泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314A VWD檢測(cè)器、Chemstation 6.01色譜工作站）；HS3120型超聲波提取器 （300 W，100 kHz，中國(guó)昆山禾創(chuàng)超聲儀有限公司）；Sartorius BT224S電子天平 （十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius公司）；METTLER TOLEDO XS105電子天平 （百萬(wàn)分之一，瑞士METTLER TOLEDO公司）；MUL—9000Series超純水系統(tǒng) （美國(guó) Millipore公司）。

1.2 試藥 實(shí)驗(yàn)共收集10批青葙子樣品 （QXZ-1～QXZ-10），各批藥材經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)生藥學(xué)與藥用植物學(xué)教研室李會(huì)軍教授鑒定為莧科植物青葙Celosia argentea L.的干燥成熟種子，憑證標(biāo)本保存于天然藥物活性與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國(guó)藥科大學(xué)）。青葙苷I對(duì)照品由本實(shí)驗(yàn)室制備，經(jīng)HR-ESI-MS、1D-、2D-NMR鑒定結(jié)構(gòu) （圖1），經(jīng)HPLC-ELSD法測(cè)定純度達(dá)98.5%以上。乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品貯備液的制備 精密稱(chēng)取青葙苷I對(duì)照品1.94 mg，置5 mL量瓶中，加水溶解，定容，搖勻，即得0.388 mg/mL的青葙苷I對(duì)照品貯備液。

圖1 青葙苷I的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of celosin I

2.1.2 供試品溶液的制備 取干燥至恒定質(zhì)量的青葙子粉末 （過(guò)40目篩）約1 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，加50%甲醇50 mL，稱(chēng)定，熱回流提取1 h，放冷，補(bǔ)足失質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘?jiān)铀芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，定容，搖勻，過(guò)0.45 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液為供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) Shim-pack CLC-ODS色譜柱 （6.0 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈 （A）-0.1%甲酸 （B），梯度洗脫，0～5 min（20%A），5 ～ 10 min（20%→30%A），10～20 min（30%→36%A），20～27 min（36%A），27～30 min（36%→100%A），30～35 min（100%A）；體積流量1 mL/min；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度105℃，載氣體積流量2.8 L/min。在該色譜條件下，青葙苷I色譜峰的分離度大于1.5（見(jiàn)圖2）。

圖2 對(duì)照品和樣品的色譜圖Fig.2 Chromatogramsofreference substances and sample

2.3 專(zhuān)屬性考察 采用液質(zhì)聯(lián)用的方法進(jìn)行專(zhuān)屬性考察，色譜分離按2.2項(xiàng)色譜條件，檢測(cè)器采用Agilent 1100 series LC/MSD系統(tǒng) （Agilent，Germa-ny），電噴霧 （ESI）離子源。質(zhì)譜檢測(cè)條件為：Scan mode（m/z 100～1 500），負(fù)離子模式，氮?dú)怏w積流量為9.0 L/min，干燥氣體溫度為320℃，霧化壓力35 psig（1 psig=68 194.8 Pa），毛細(xì)管電壓3 500 V。結(jié)果表明，在選定的色譜條件下，青葙苷I色譜峰為單一成分，空白溶劑及樣品中其他成分無(wú)干擾。見(jiàn)圖3。

圖3 空白溶劑、對(duì)照品及樣品總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of black，reference substance and sample

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 制備一定質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液并稀釋得到6個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品稀釋溶液（分 別 為 0.640、0.384、0.320、0.160、0.080、0.040 mg/mL）。按2.2項(xiàng)色譜條件，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并以最小二乘法計(jì)算得回歸方程：Y =1.045 5 X+7.278 5（r2=0.999 4），表明青葙苷I在0.4～6.4 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值與峰面積的對(duì)數(shù)值之間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 檢測(cè)限及定量限測(cè)定 按2.2項(xiàng)色譜條件，首先進(jìn)樣空白溶劑，測(cè)出對(duì)照品出峰位置的基線(xiàn)噪音水平。再進(jìn)樣線(xiàn)性測(cè)定中濃度最低的青葙苷I對(duì)照品稀釋溶液，根據(jù)其對(duì)應(yīng)的峰高值，將此溶液稀釋至約3倍信噪比的濃度 （S/N=3），即為檢測(cè)限 （LOD）；約10倍信噪比的濃度 （S/N=10）即為定量限 （LOQ），結(jié)果青葙苷I LOD為0.272 μg，LOQ 為 0.466 μg。

2.6 精密度試驗(yàn) 取青葙苷I對(duì)照品貯備液（0.388 mg/mL），于一天之內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD值為2.6%（n=6），作為日內(nèi)精密度；連續(xù)進(jìn)樣3 d，每天進(jìn)樣3次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD值為2.8%（n=9），作為日間精密度；實(shí)驗(yàn)室另一操作人員按2.3項(xiàng)制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定青葙子粉末中青葙苷I的量，每個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)3次，測(cè)定，計(jì)算RSD值為2.8%（n=6），作為中間精密度。結(jié)果表明精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次青葙子粉末 （QXZ-1）6份，每份1 g，精密稱(chēng)定，按2.3項(xiàng)制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算青葙苷 I含有量為 （0.233 0 ±0.005 7）%，RSD值為3.1%（n=6）。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性較好。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取已準(zhǔn)確測(cè)定含有量的青葙子粉末 （QXZ-1）約0.5 g，共9份，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入高、中、低質(zhì)量濃度 （分別為1.342、1.170、0.944 mg/mL）的對(duì)照品溶液適量，按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明，高、中、低三個(gè)質(zhì)量濃度的加樣回收率均在95%～105%范圍內(nèi)，RSD為2.6% （結(jié)果見(jiàn)表1）。

表1 青葙子中青葙苷I的加樣回收率Tab.1 Recovery tests of celosin I in Celosiae Semen

2.9 耐用性考察

2.9.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取青葙子粉末1 g，精密稱(chēng)定，按2.3項(xiàng)制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算RSD值為2.8% （n=6），結(jié)果發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性良好。

2.9.2 不同色譜柱的考察 采用Agilent1100系列高效液相色譜儀，考察了3種類(lèi)型C18色譜柱對(duì)分離度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青葙苷I均能得到較好的分離 （如圖4所示）。

圖4 不同色譜柱的色譜圖Fig.4 Chromatograms of different columns

3 樣品測(cè)定

取青葙子樣品，按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品貯備液5 μL、10 μL，供試品溶液 10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，按外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算青葙苷I量。10批青葙子測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同產(chǎn)地青葙子中青葙苷I測(cè)定結(jié)果 （n=3）Tab.2 Contents of celosin I in different samples（n=3）

4 討論

皂苷常用的定量方法主要為高效液相色譜法（HPLC），所用檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器 （UV）和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 （ELSD）。由于皂苷類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)中缺乏共軛體系，因此在選用UV時(shí)常在末端吸收區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，易導(dǎo)致基線(xiàn)不穩(wěn)。ELSD為質(zhì)量通用型檢測(cè)器，其響應(yīng)值與樣品的質(zhì)量成正比，不依賴(lài)于樣品的光學(xué)特性，不受化合物官能團(tuán)的影響，可消除流動(dòng)相的配比變化對(duì)基線(xiàn)產(chǎn)生的影響，在皂苷類(lèi)成分的分析中被廣泛應(yīng)用［9-13］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比UV（203 nm）和ELSD檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在采用梯度洗脫程序時(shí)前者基線(xiàn)漂移較大，不能準(zhǔn)確定量目標(biāo)成分；后者基線(xiàn)平穩(wěn)，且靈敏度更高。故本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD法測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件如提取溶劑、提取方式、提取時(shí)間進(jìn)行考察，綜合考慮青葙苷I提取率、提取時(shí)間等因素，最終確定提取溶劑為50%甲醇，提取方式為加熱回流，提取時(shí)間為1 h。實(shí)驗(yàn)還比較了Agilent Extend C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）、Innovation TMInfinite C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Shim-pack CLC-ODS（6.0 mm×150 mm，5 μm）等3種不同類(lèi)型的色譜柱，結(jié)果在這3種類(lèi)型色譜柱上青葙苷I均能得到基線(xiàn)分離，表明本實(shí)驗(yàn)的色譜條件具有較好的適用性。

樣品測(cè)定結(jié)果表明10批青葙子藥材中青葙苷I的量在0.166 7%～0.313 2%之間，平均含有量為0.228 2%，高于文獻(xiàn)報(bào)道青葙苷A（0.051 2%～0.114 3%）和青葙苷B量（0.010 9% ～0.081 5%），故認(rèn)為青葙苷I為青葙子的主要成分，可作為青葙子的質(zhì)量控制指標(biāo)。

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Assay of celosin I in Celosiae Semen by HPLC-ELSD

WANG Yu-mei， YU Yue， LI Hui-jun*
（State Key Laboratory of Natural Medicines，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

Celosiae Semen；HPLC-ELSD；celosin I

R284.1

A

1001-1528（2013）09-1957-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.09.029

2013-04-18

2010—2011年度國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高科研項(xiàng)目 （661）

王玉梅 （1986—），女，碩士生，主要從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel：18762407833，E-mail：mouyuzi@163.com

*通信作者：李會(huì)軍，男，教授，主要從事中藥活性成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel：（025）83271382/13813985884，E-mail：cpuli@163.com