袁王俊， 張維瑞， 吳宏欣， 薛愧玲， 李 勉*

（1.河南大學(xué)中藥研究所，河南開封475004；2.河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南開封 475004）

HPLC 法測定柴胡不同部位4種黃酮類成分

袁王俊1， 張維瑞1， 吳宏欣2， 薛愧玲1， 李 勉1*

（1.河南大學(xué)中藥研究所，河南開封475004；2.河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南開封 475004）

目的 定量測定開封市場上不同部位和不同產(chǎn)地柴胡中4種黃酮 （蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素）。方法以O(shè)DS2色譜柱、乙腈-0.12%磷酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，體積流量為1 mL/min，檢測波長為360 nm。結(jié)果

樣品間的黃酮成分的量存在明顯差異。葉片中蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的總量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于柴胡根中。結(jié)論 柴胡莖和葉中4種黃酮總量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的入藥部位根中的量，有必要對(duì)柴胡莖、葉進(jìn)行進(jìn)一步的研究和開發(fā)。

柴胡；HPLC；根；莖；葉；黃酮

中藥柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.和狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，前者習(xí)稱北柴胡，后者習(xí)稱南柴胡。柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品［1］。柴胡能疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣，用于感冒發(fā)熱、寒熱往來、胸脅脹痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂、脫肛等癥［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明，柴胡還具有抗炎、促進(jìn)免疫功能，抗肝損傷和抗輻射損傷等作用［3］。柴胡在我國分布廣泛，除西藏外，各地均有分布。

柴胡為常用大宗藥材，其重要的藥用價(jià)值使需求逐年增加，不僅國內(nèi)需要量大，且大量出口。由于長期依賴采挖，野生資源及其生境破壞嚴(yán)重，資源已近枯竭，目前商品柴胡主要依賴栽培。柴胡存在嚴(yán)重的種內(nèi)和種間類型混雜的現(xiàn)象。導(dǎo)致柴胡品種優(yōu)劣不等的問題［4］。不同地區(qū)使用的藥用部位也不盡相同。藥典規(guī)定柴胡的藥材為柴胡的根，但市場上的藥材往往是根和5～10 cm的莖的混品入藥。有人則以地上部分入藥。

柴胡中的有效成分為柴胡皂苷、甾醇、揮發(fā)油和多糖等，此外，還含有黃酮類成分，黃酮類化合物對(duì)人體在抗腫瘤、抗衰老及心血管等疾病的治療和預(yù)防有重要意義［5-6］。如蘆丁具有抗氧化、抗基因突變和降低毛細(xì)血管異常通透性及脆性的作用，臨床上用于治療過敏性紫癜及各種因毛細(xì)血管脆性增加而引起的出血性疾病，也用于治療高血壓和老年氣管炎等。槲皮素是黃酮類化合物中具有代表性的一種，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗糖尿病并發(fā)癥等多種生物活性及藥理作用，對(duì)呼吸道疾病，特別是對(duì)哮喘病和支氣管疾病有較好的作用［7-8］。

本研究采用HPLC法對(duì)來自開封市場上的柴胡樣品進(jìn)行了分析，（1）考察不同產(chǎn)地的柴胡藥材中4種黃酮類成分的量；（2）考察同批藥材根、莖、根和莖混品4種黃酮類成分的量；（3）考察葉、莖、莖葉混合品的4種黃酮類成分的量。

1 藥材、儀器與試劑

1.1 藥材來源 柴胡藥材共7批，其中原藥材2批，分別來自鞏義五指山和洛陽嵩縣，來自陜西的1批藥材為莖葉混品，狹葉柴胡的根 （南柴胡）2批 （編號(hào)18和19），其余均為飲片，所有藥材購自開封各藥店和醫(yī)院藥房。經(jīng)李勉高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為柴胡Bupleurum chinense的根 （包含5～10 cm的莖）、莖葉和狹葉柴胡B.scorzonerifolium的根。

蘆丁 （批號(hào)20736-09-8）、槲皮素 （批號(hào)117-39-5）、山柰素 （批號(hào)491-54-3）、異鼠李素 （批號(hào)480-19-3）的對(duì)照品均購自上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司，純度均大于98%。

1.2 儀器與藥品 Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國 Agilent公司，包括 G1311C四元梯度泵，G1329B自動(dòng)控溫自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1314B可變波長紫外檢測器；ChemStation6.01色譜工作站）。乙腈、磷酸均為色譜純，水為樂百氏純凈水，甲醇為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品處理 為了分析根所帶部分莖對(duì)藥材質(zhì)量的影響，將來自洛陽嵩縣和河南鞏義的藥材分為根、莖和根與莖 （1∶1）混合3種。同時(shí)將來自陜西的地上部分分為葉、莖和葉與莖 （1∶1）混合3種。將材料40℃烘干，粉碎，過60目篩。取各樣品粗粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液25 mL，密塞，30℃水溫超聲處理1 h，濾過，回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中定容，用0.45 μL微孔濾膜濾過［9］。

2.2 定量測定

2.2.1 色譜條件 依利特Hypersil ODS2色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相為乙腈 （A）-0.12%磷酸水 （B）梯度洗脫，0～15 min（5% ～20%A）15～30 min（20% ～25%A），30～45 min（25% ～45%A），45～55 min（45% ～50%A），55～60 min（50% ～5%A）；洗脫時(shí)間為60 min；檢測波長360 nm；流量1.0 mL/min；柱溫為常溫，進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 準(zhǔn)確稱取蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素對(duì)照品各約5 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。混勻后分別進(jìn)樣 5、10、15、20、25 μL，按上述色譜條件作HPLC分析。以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸處理，得蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的線性回歸方程和線性范圍，見表1。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 將柴胡皂苷混和對(duì)照品溶液按同樣色譜條件進(jìn)行HPLC分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素 的 RSD 分 別 為 1.37%、1.375%、1.35%、1.61%。

表1 4種黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.1 Calibration curves of four flavonoids

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取7號(hào)樣品粗粉約10 g，一式5份，按樣品溶液制備方法進(jìn)行提取，按上述色譜條件進(jìn)樣20 μL，結(jié)果樣品中蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的 RSD分別為0.96%、0.47%、2.85%、1.64%。

2.2.5 回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取7號(hào)樣品粗粉約2 g，精密加入蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素混標(biāo)溶液0.5 mL、1.0 mL，一式3份，按樣品溶液制備方法進(jìn)行提取，以同樣色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的平均回收率分別為101.6%，99.7%，103.2%，99.9%，RSD分別為1.32%、0.99%、3.01%、1.56%。

2.2.6 樣品測定 對(duì)照品、樣品圖譜見圖1、2。結(jié)果見表2。

圖1 對(duì)照品的HPLC色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference substances

3 討論

圖2 樣品的HPLC色譜圖Fig.2 Chromatogram of sample（No.1）

3.1 不同產(chǎn)地柴胡飲片 （根和莖）中4種黃酮含量 柴胡是常用的中藥，以柴胡為君藥生產(chǎn)的中成藥多達(dá)幾十種［10］，而柴胡又分布廣泛，不同產(chǎn)地的藥材其質(zhì)量的穩(wěn)定性就顯得非常重要。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可看出，測定的11個(gè)不同產(chǎn)地和批次的樣品中，蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的總量有著明顯的差異，最低為來自河北的樣品，僅為0.166 mg/g，其次是來自南陽的樣品，為0.237 mg/g；而總量最高的為來自內(nèi)蒙古的樣品，為2.085 mg/g，其次為來自禹州的一個(gè)樣品，為1.903 mg/g，這個(gè)結(jié)果與韋英杰等［9］的結(jié)果是一致的。來自同一個(gè)產(chǎn)地不同批次的樣品其4種黃酮的總量也存在較大的差異，來自禹州的兩批樣品的蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的總量分別為1.903 mg/g和0.547 mg/g；來自洛陽兩個(gè)批次樣品的蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的總量分別為0.976 mg/g和0.538 mg/g。4種黃酮成分在樣品中的分布也沒有規(guī)律，來自內(nèi)蒙古的柴胡樣品中4種黃酮量高達(dá)2.085 mg/g，但僅含有山柰素一種黃酮；蘆丁在來自洛陽的兩個(gè)批次中量分別為0.578 mg/g和0.047 mg/g。因此，柴胡的黃酮總量表現(xiàn)出一定的地域性，也存在差異性。從表2還可以看出，收集的南柴胡樣品總黃酮量分別為0.331和0.354 mg/g。究其原因是柴胡在我國分布廣泛，目前種植柴胡種子來自野外收集，存在嚴(yán)重的種內(nèi)和種間類型混雜的現(xiàn)象，柴胡又屬于異花授粉，因此個(gè)體間差異明顯。要想保證柴胡藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性和有效性，有必要收集柴胡種質(zhì)資源，開展雜交育種研究，培育優(yōu)良品種，開展藥材生產(chǎn)管理規(guī)范（GAP）。

表2 柴胡樣品中4種黃酮測定結(jié)果Tab.2 Source of Bupleurum chinense samples and contents of four flavonoids

3.2 根、莖、根和莖混品4種黃酮類成分的量藥典規(guī)定柴胡的藥材為柴胡的根，但市場上的藥材往往是根和5～10 cm莖的混品入藥。本研究測定了兩個(gè)產(chǎn)地根、莖和根和莖混合品的4種黃酮的量，莖的總黃酮量最高，分別為0.973 mg/g和1.614 mg/g，根的總黃酮量最低，本別為0.13 mg/g和0.443 mg/g，其混合品的量介于二者之間，分別為0.774 mg/g和0.976 mg/g。總之，莖的存在使柴胡黃酮含量提高。

3.3 葉、莖、莖葉混合品的4種黃酮類成分的量與傳統(tǒng)的藥用部位相比，葉片、莖和莖葉混合品的4種黃酮總量要明顯高出很多，分別為15.667 mg/g、10.034 mg/g和12.557 mg/g。傳統(tǒng)藥用部位最高僅為2.085 mg/g。還可以看出，葉片中4種黃酮總量最高，莖最低，混合品介于二者之間。比較與根緊密相連的莖和葉片中的莖，可以發(fā)現(xiàn)，葉片中的莖含量明顯要高?？傊?，就黃酮量分析葉片和莖的含有量要高于傳統(tǒng)使用的根。小葉黑柴胡傳統(tǒng)的入藥部位也是根，劉秀芳等［11］研究認(rèn)為小葉黑柴胡莖葉總黃酮具有很好的抗氧化活性；詹雪晶等［12］研究認(rèn)為柴胡莖葉總黃酮對(duì)四氯化碳 （CCl4）所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。很有必要對(duì)莖、葉進(jìn)行進(jìn)一步的研究，探討其替代根的可能性，擴(kuò)大柴胡用藥部位，保護(hù)野生資源。

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Determination of four flavonoids in different parts of Bupleurum chinense by HPLC

YUAN Wang-jun1， ZHANG Wei-rui1， WU Hong-xin2， XUE Kui-ling1， LI Mian1*
（1.Institute of Chinese Materia Medica，Henan University，Kaifeng 475004，China；2.College of Life Sciences，Henan University，Kaifeng 475004，China）

Bupleurum chinenseDC.；HPLC；root；stem；leaf；flavonoid

R284.1

A

1001-1528（2013）04-0797-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.038

2012-05-10

國家自然科學(xué)基金 （30971076）

袁王俊 （1972—），男，講師，研究方向：中藥資源。E-mail：yuanwangjun@henu.edu.cn

*通信作者：李 勉 （1954—），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：中藥鑒定。E-mail：limian0378@163.com