李翔國，全炳武，李虎林，樸仁哲，金大勇

（延邊大學農(nóng)學院農(nóng)學系，吉林 延吉 133002）

人參中所含皂苷隨品種的不同［1］、年生［2］、栽培方法［2－3］、栽植位置［4］、生育期［5］、受光量［6－7］等而有較大的差異。人參根部的皂苷主要分布在形成層的外邊部即皮層部位，占人參根部絕大部分面積的木質(zhì)部和髓部幾乎沒有［8－9］。而 Samukawa等［10］的研究表明，人參皂苷在表皮部位分布最多，雖然量少但是篩管和木質(zhì)部也有一小部分存在。以上結(jié)論說明，皂苷雖分布在整個根部，但是大部分在周皮部位。Kim等［11］的研究也表明，6年生高麗參根部中主根、支根和須根所占的比率分別為47.7%、34.1%、14%，其余部分由蘆頭組成；同時皮層和木質(zhì)部比例在主根和支根中分別為1∶1和2∶1，須根部位中則幾乎沒有木質(zhì)部，大部分為皮層；但是須根的含皂苷量卻為主根的4倍，支根的2倍左右，這是因為須根的根徑雖比支根和主根小，表皮所占的比率則比支根和主根大。由此可以預見，根徑越小皮層所占的比率越大，且含人參皂苷量也越多。

目前，國內(nèi)外已報道的人參皂苷含有量與各種因素間的相關性研究有:皂苷含有量與粗纖維、脂肪、灰分、無機成分間的相關性［12］、6年生人參的根徑與總皂苷含有量間的相關性［13］、利用不同養(yǎng)分組成來栽培的2年生人參的根質(zhì)量、總皂苷含有量與單體皂苷含有量間的相關性［14］、葉綠素含有量與葉片皂苷含有量間的相關性［15］研究等。但是，到目前為止，試驗所用的人參品種為混種，個體間差異較大，因而對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響也較大。另外，許多科學家在皂苷定量研究分析方面，雖然以根質(zhì)量、不同部位、年生等進行區(qū)分，但盡管是同一年生、同一根質(zhì)量，其根徑都有差異。本研究為了彌補上述缺點給研究分析帶來的影響，采用同一品種進行了皂苷含有量與根徑間的相關性研究。

1 試驗材料、儀器與試藥

1.1 試驗材料 來自韓國忠南大學校人參圃內(nèi)移植栽培的6年生連豐 (Yunpoong)作為供試品種。在韓國，高麗參品種連豐早在2002年被育成為品種并登錄，其主要特性為多莖、主根短粗，圓筒狀、產(chǎn)量高 (見圖1)。

1.2 試驗儀器 高效液相色譜儀［Futecs model NS－4000 apparatus(Daejeon，Korea)，配蒸發(fā)光檢測器 ELSD Softa 300s］；PRONTOSIL NC色譜柱(250 mm×4.6 mm)；測徑兩腳器［Digmatic caliper CD－15CP(Mitutoyo Corp.Japan)］；冷凍干燥機(Model FD－8512，Ilshin Lab Co.，Ltd，Korea)；粉碎機 (WB－1，220 ～240V，820W，SANPLATEC CORP.)；超聲波振蕩器 (60 kHz，heat power 330 W；JAC Ultrasonica 4020，KODO，Korea)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (LABOROTA 4000 efficient，Heidolph Instruments GmbH ＆ Co.KG，GERMANY)。

圖1 高麗參品種連豐Fig.1 Panax ginseng cultivar Yunpoong

1.3 試藥、試劑 對照品人參皂苷 Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2及 Rh1均購于中國藥品生物制品檢定所，乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 流動相A為水－乙腈(97∶3)，流動相B為20 mmol/L乙酸銨－乙腈－甲醇 (55∶40∶5)，流動相 C為水－乙腈 (10∶90)，A－B－C 不同比例梯度洗脫，0 min(100∶0∶0)、7 min(60∶40∶0)、12 min(48∶52∶0)、31 min(42∶58∶0)、50 min(25∶75∶0)、66 min(20∶80∶0)、84 min(15∶85∶0)、100 min(0∶100∶0)、112 min(0∶50∶50)、130 min(0∶20∶80)，體積流量0.8 mL/min，柱溫35℃。

2.2 根徑的測定方法及結(jié)果 供試材料用測徑兩腳器分別測定主根、支根、須根各部位中間位置的直徑后，主根以42.0～44.0 mm、36.0～40.0 mm、27.0～30.0 mm、23.0～24.0 mm，支根以18.0～20.0 mm、13.0～14.0 mm、8.0～10.0 mm、6.0～7.0 mm，須根以3.0～4.0 mm、2.0～2.5 mm、1.0～1.5 mm再進行分類。區(qū)分好的根部各部位的中間位置按0.8 cm的厚度切成片狀，主根和支根分別稱取50 g、須根30 g，各部位定量稱取3次，在－83℃的冷凍干燥機凍干3 d后測定干質(zhì)量并算出參根干質(zhì)量與鮮質(zhì)量的比例 (簡稱干鮮比)。

干鮮比是人參的重要經(jīng)濟性狀之一，也是確定人參適宜收獲期的重要依據(jù)。研究表明，3～4年生的人參，由于生長年限短，干物質(zhì)積累相對較少，干鮮比偏??；5年生的人參，生長年限相對較長，干物質(zhì)積累相對較多，所以干鮮比有所提高。本研究測定了6年生連豐各部位的干鮮比隨根徑的變化，見表1。主根、支根、須根的干鮮比分別為29.0% ～31.8%、27.3% ～28.5%、23.7% ～26.9%，主根的干鮮比略高于支根和須根，同一部位的干鮮比隨著根徑的增大而增高。這種現(xiàn)象有可能是因為木質(zhì)部在根部中所占的比率、組織稠密度等影響了干質(zhì)量的變化。

2.3 樣品的處理方法 將Shi等［16］的皂苷提取方法稍微進行變化。準確稱取3 g供試材料至250 mL三角瓶，加入75 mL 70%乙醇溶解搖勻并置于超聲波振蕩器，在 (60±5)℃超聲提取1 h。冷卻過濾后殘余試料再進行2次提取。將3次提取后的濾液加在一起用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃減壓濃縮后用25 mL重蒸水充分溶解并收回。

表1 6年生連豐根部各部位的干鮮比隨根徑的變化Tab.1 Changes of ratio of dry weight to fresh weight by root diameter with different root par ts of 6-year-old Yunpoong

皂苷定量分析前采用Choi等［5］的方法進行樣品前處理。即先用5 mL甲醇激活C18固相萃取柱，后用5 mL重蒸水過渡，將體積流量控制在1 mL/min，待樣液過柱后用5 mL重蒸水淋洗除去糖類，再用5 mL 20%甲醇淋洗除去脂類，最后用10 mL 90%甲醇洗脫，將洗脫液收集于20 mL量瓶中，定容后經(jīng)0.45 μm聚四氟乙烯濾紙 (Waters，Milford，MA，USA)過濾后上機待測。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密稱取人參皂苷對照品各適量，分別加水制成每1 mL含Rb11 mg、Rb20.125 mg、Rb30.025 mg、Rc 0.33 mg、Rd 0.033 mg、Re 0.4 mg、Rf 0.05 mg、Rg10.2 mg、Rg20.025 mg、Rh10.05 mg的溶液。精密吸取同一濃度的各對照品溶液0.25、0.5、1.25、2.5、5 mL于50 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻；按上述色譜條件進樣20 μL，以各皂苷的峰面積積分值為橫坐標，以各皂苷的質(zhì)量濃度為縱坐標進行線性分析，得回歸方程和相關系數(shù)。結(jié)果，Rb1為y=239.20x+1.200，r=0.9998；Rb2為 y=295.08x+1.239，r=0.9992；Rb3為 y=474.34x+3.157，r=0.9997；Rc為 y=266.29x+1.157，r=0.9999；Rd為y=278.07x+1.173，r=0.9995；Re為y=296.24x+1.726，r=0.9982；Rf為 y=284.69x+1.452，r=0.9994；Rg1為 y=336.92x+1.475，r=0.9995；Rg2為 y=306.73x+5.118，r=0.9985；Rh1為 y=505.52x+1.265，r=0.9999，且各對照品的線性關系均良好。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取低、中、高3個質(zhì)量濃度的樣品，每個濃度設3個平行，連續(xù)5 d進行測定，峰面積代入標準曲線公式中計算濃度。以每種濃度水平的樣品日內(nèi)變化和日間變化來確定試驗的精確度，結(jié)果日內(nèi)和日間RSD分別為1.6%～3.4%、2.6%～3.5%，說明精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 分別取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12 h及24 h測定，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果RSD為1.11%～1.78%，說明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 回收率試驗 精密量取已知量的同一樣品(20091008)1.5 g，加入精密量取的各人參皂苷對照品，按2.3項平行操作6份測定結(jié)果見表2。平均回收率在98.45%～99.72%，RSD為1.27%～1.72%說明本方法準確度較高。

表2 各組分回收率測定結(jié)果 (n=6)Tab.2 Recovery determination results(n=6)

圖26 年生連豐的不同部位間 (A)、不同根徑間 (B)的總皂苷含有量比較Fig.2 Comparison of total ginsenoside content by root parts(A)and root diameter(B)of 6-year-old Yunpoong

2.5 各部位的皂苷含有量隨根徑的變化 6年生連豐各部位的總皂苷量隨根徑的變化而變化，見圖2。主根、支根、須根的總皂苷量分別為19.1、40.0、114.9 mg/g，各部位間差異較大。主根的根徑在42.0～44.0 mm、36.0～40.0 mm、27.0～30.0 mm、23.0～24.0 mm時總皂苷量為15.5、19.4、19.8、21.6 mg/g；支根的根徑在18.0～20.0 mm、13.0～14.0 mm、8.0～10.0 mm、6.0～7.0 mm時總皂苷量為28.8、33.2、37.7、60.4 mg/g；須根的根徑在3.0～4.0 mm、2.0～2.5 mm、1.0～1.5 mm時總皂苷量為 96.7、124.9、123.3 mg/g。主根和支根的總皂苷量隨著根徑的減小而增多，尤其在支根表現(xiàn)得更為突出。須根也有相同的規(guī)律，但是根徑小于2.5 mm時沒有顯著的變化。由此可以估算出主根、支根、須根的根徑每減少1 mm時總皂苷量分別增加0.3、2.6、10.2 mg/g。

6年生連豐各部位的單體皂苷量隨根徑的變化而變化，見表3。除了Rg1外的各單體皂苷量及二醇型皂苷/三醇型皂苷為須根＞支根＞主根。隨著主根根徑的降低Rb2、Rf、Rg2量增多，Rb3、Rd、Rh1量沒有變化；支根除了Rg1量隨著根徑的降低減少外，其余單體皂苷、二醇型皂苷/三醇型皂苷則增多；須根的Rg1量隨著根徑的降低減少，Rb1、Rd、Re、Rg2、Rh1量則增多。

表3 6年生連豐的單體皂苷含有量隨不同部位、不同根徑間的比較Tab.3 Comparison of ginsenoside content by root diameter with different root parts of 6-year-old Yunpoong

2.6 皂苷含有量與根徑間的相關性 6年生連豐的皂苷含有量與根徑間的相關性分析結(jié)果見表4?？傇碥蘸辛颗c根徑間表現(xiàn)出高的負相關，其相關系數(shù)為－0.80；二醇型皂苷、三醇型皂苷及二醇型皂苷/三醇型皂苷也與根徑表現(xiàn)出高的負相關，其相關系數(shù)在－0.89～－0.80；除了Rg1外的各單體皂苷與根徑間表現(xiàn)出高的負相關，相關系數(shù)在－0.83～－0.70，而Rg1則表現(xiàn)出0.65的正相關關系。

3 討論

人參皂苷被視為是人參中的活性成分，因而成為研究的目標。但是，到目前為止，絕大部分試驗所用的人參品種為混種，個體間差異較大，因而對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響也較大。Kim等［13］的研究表明，6年生人參的根徑與總皂苷含有量間具有高的負相關，須根的總皂苷含有量較主根和支根多，但是沒提及所用材料的根徑范圍，所以無法與本試驗結(jié)果做直接比較。Christensen等［17］分析了西洋參根質(zhì)量與皂苷量間的相關性，結(jié)果Rd與根質(zhì)量間具有低的負相關外，其余單體皂苷與根質(zhì)量間無相關性。

表4 6年生連豐的皂苷含有量與根徑間的回歸方程和相關系數(shù)Tab.4 Regression equation and correlation coefficient between root diameter and ginsenoside content in 6-year-old Yunpoong

Kim等［11］的研究表明，人參主根部位的皮層和木質(zhì)部比例約為1∶1，支根部位的皮層和木質(zhì)部比例為2∶1，須根部位中則幾乎沒有木質(zhì)部，大部分為皮層。

本研究結(jié)果表明，須根的皂苷含有量約為支根的2倍，主根的4倍，各部位的皂苷含有量隨根徑的降低而增多。這可能是因為支根和須根的根徑較主根小得多，所以皮層所占的比率在須根最大，隨著根徑的增大木質(zhì)部所占的比率明顯大于皮層所占的比率，隨之皂苷含有量與根徑間具有負的相關性。

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