劉新宇， 劉春娜， 鄭久明

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州 121001）

夏枯草水提液對(duì)人甲狀腺細(xì)胞NO生成及其與攝碘率相關(guān)性影響

劉新宇1， 劉春娜2*， 鄭久明2

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州 121001）

目的 旨在觀察中藥夏枯草水提液對(duì)人甲狀腺細(xì)胞一氧化氮 （NO）生成、攝碘率及鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)體 （NIS）表達(dá)的影響，探討其增強(qiáng)甲狀腺細(xì)胞碘攝取的分子機(jī)制。方法 選用人甲狀腺腺瘤旁正常甲狀腺組織，采用細(xì)胞原代培養(yǎng)方法及半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) （RT-PCR）技術(shù)，觀察夏枯草水提液對(duì)體外培養(yǎng)人甲狀腺細(xì)胞NO生成、碘攝取及NIS表達(dá)的影響。結(jié)果 經(jīng)促甲狀腺激素 （TSH）（200 μIU/mL）處理的人甲狀腺細(xì)胞，夏枯草水提液抑制其NO的生成，增強(qiáng)碘的攝取及NIS的表達(dá)，其中夏枯草 （100 g/L）作用最強(qiáng)，并且后二者呈正相關(guān) （r=0.88）。結(jié)論

目前，中藥夏枯草在臨床上主要用于治療甲狀腺腫大、瘰疬、淋巴結(jié)核、癭瘤、乳癰、肺結(jié)核、乳癌、筋骨疼痛、急性傳染性肝炎等。臨床上用夏枯草治療甲狀腺疾病已有久遠(yuǎn)的歷史，夏枯草可輔助治療甲狀腺功能亢進(jìn)、亞急性甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎、單純性甲狀腺腫和甲狀腺功能減退［1］，在細(xì)胞水平夏枯草可促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡［2］，增加甲狀腺癌細(xì)胞碘的攝取及鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)體 （NIS）的表達(dá)［3］，但夏枯草與甲狀腺細(xì)胞碘攝取之間的關(guān)系尚缺乏進(jìn)一步的探討。本實(shí)驗(yàn)主要觀察夏枯草對(duì)體外培養(yǎng)人甲狀腺細(xì)胞碘攝取的影響，驗(yàn)證該作用與一氧化氮 （NO）是否相關(guān)，探討其對(duì)甲狀腺細(xì)胞碘攝取影響的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 甲狀腺組織取材方法及實(shí)驗(yàn)分組 甲狀腺腺瘤旁正常的甲狀腺組織 （遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院手術(shù)室提供）。

1.2 夏枯草水提液配制 40 g夏枯草加蒸餾水400 mL，煮沸30 min后過濾除渣，熬制成濃縮液并定容至40 mL，濾液濃縮質(zhì)量濃度為1 g/mL，經(jīng)120℃ 30 min高壓滅菌，用直徑為22 μm的微孔濾膜正壓過濾。按藥物質(zhì)量濃度分為4個(gè)質(zhì)量濃度組 （0、50、100、200 g/L）。

1.3 試劑與儀器 牛TSH、F-12培養(yǎng)基：Sigma公司；MMLV：Promega公司；NO檢測試劑盒：南京建成生物公司；GibcoBRL公司；Trizol試劑：Na125I：由中國人民解放軍205醫(yī)院同位素科惠贈(zèng)。

2 方法

2.1 甲狀腺細(xì)胞培養(yǎng) 手術(shù)中剝離甲狀腺腺瘤旁正常甲狀腺組織，以無鈣鎂Hank's液沖洗2次，剪碎。0.25% 膠原酶消化和0.25% 胰酶60 min，1 200 r/min離心10 min，將離心后的沉淀物制成細(xì)胞懸液，懸于含有15%胎牛血清和200 μIU/mL促甲狀腺激素 （TSH）的F-12培養(yǎng)液當(dāng)中。采用臺(tái)盼藍(lán)染色證明活細(xì)胞＞95%，調(diào)整細(xì)胞數(shù) （5×105）并接種于培養(yǎng)瓶，37℃，CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h換液。

2.2 測定NO 將甲狀腺細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，貼壁生長72 h，加入夏枯草 （0、50、100、200 g/L），各藥物質(zhì)量濃度接種8復(fù)孔，硝酸還原酶法，550 nm處測定吸光度值。觀察經(jīng)夏枯草孵育 （24 h、48 h、72 h）后對(duì)NO產(chǎn)生的影響。

2.3 碘攝取率的測定 將甲狀腺細(xì)胞細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，貼壁生長 72 h，加入夏枯草 （0、50、100、200 g/L），各藥物質(zhì)量濃度接種8復(fù)孔，孵育24 h，用1 mL冷HBSS漂洗2次。10 μmol/L的KI，內(nèi)含0.000 5 mL Na125I（15 000 cpm），37℃，水浴40 min，冰的HBSS漂洗2次。加入0.5 mL HBSS（內(nèi)含20 mmol/L KClO425 μL），37℃，30 min后γ-記數(shù)器記數(shù)。觀察經(jīng)夏枯草孵育 （24 h、48 h、72 h）后對(duì)碘攝取率的影響。

2.4 NIS mRNA檢測 采用半定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測。將上述細(xì)胞置于含夏枯草 （0、50、100、200 g/L）中，孵育24 h，Trizol試劑提取總 RNA。以逆轉(zhuǎn)錄酶 （M-MLV）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，β-actin：順 5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3'， 反 5'-CTAGAAGCATTGCGGTGGACGATGGAGGG-3'，PCR引 物 NIS：5'-CTCCCTGCTAACGACTCCAG-3'，反 5'-AACAGACGATCCTCATTGGTG-3'，擴(kuò)增片段長度分別為392 bp及661 bp。PCR的反應(yīng)條件為97℃ 5 min、93℃ 3 min，預(yù)變性，93℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 45 s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min末循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠 （含溴乙錠）進(jìn)行電泳，以100 bp ladder DNA為標(biāo)志物，結(jié)果用Kodak Digital 1D Image A-nalysis Software成像系統(tǒng)掃描，測定各組光密度值，計(jì)算NIS/β-actin光密度比值。觀察經(jīng)夏枯草孵育 （24 h、48 h、72 h）后對(duì)NIS mRNA表達(dá)的影響。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示。兩組平均值比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。兩組以上均值的比較采用隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析q檢驗(yàn)。P＜0.05為具有顯著性差異，P＜0.01為差異極顯著。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

夏枯草水提液 （50、100、200 g/L）體外培養(yǎng)能夠顯著抑制人甲狀腺細(xì)胞產(chǎn)生NO，增強(qiáng)甲狀腺細(xì)胞碘攝取，同時(shí)增強(qiáng)人甲狀腺細(xì)胞NIS mRNA的表達(dá)，其中100 g/L質(zhì)量濃度的作用最強(qiáng) （表1），可顯著抑制甲狀腺細(xì)胞產(chǎn)生NO，呈時(shí)間依賴性，孵育48 h對(duì)于增強(qiáng)碘的攝取及NIS mRNA表達(dá)最顯著 （表2）。經(jīng)對(duì)培養(yǎng)人甲狀腺細(xì)胞碘攝取與對(duì)NIS mRNA表達(dá)的影響進(jìn)行相關(guān)性分析，二者呈正相關(guān)（r=0.88）。

表1 不同質(zhì)量濃度夏枯草水提液對(duì)培養(yǎng)人甲狀腺細(xì)胞NO、攝碘率和NIS表達(dá)的影響

表2 夏枯草水提液不同時(shí)間對(duì)培養(yǎng)人甲狀腺細(xì)胞NO、攝碘率及NIS表達(dá)的影響

4 討論

夏枯草是臨床經(jīng)典的治療甲狀腺疾病的輔助中藥，能增強(qiáng)甲狀腺癌細(xì)胞碘的攝取及NIS的基因表達(dá)［3］，但其作用機(jī)制尚無報(bào)道。NO已被確認(rèn)是甲狀腺細(xì)胞及各組織內(nèi)重要的信息分子，參與多種甲狀腺生理及病理過程，本實(shí)驗(yàn)室已研究證實(shí)NO能抑制體外培養(yǎng)甲狀腺細(xì)胞碘攝取、NIS mRNA表達(dá)、碘有機(jī)化以及介導(dǎo)脂多糖 （LPS）對(duì)NIS的影響［6，9-11］。

本實(shí)驗(yàn)顯示夏枯草可以抑制體外培養(yǎng)人甲狀腺細(xì)胞NO的產(chǎn)生，提高細(xì)胞對(duì)碘的攝取，增強(qiáng)NIS mRNA的表達(dá)，并呈正相關(guān) （r=0.88），結(jié)果提示夏枯草提高甲狀腺細(xì)胞的碘攝取，其可能的機(jī)制是由其增強(qiáng)NIS mRNA的表達(dá)，而通過抑制甲狀腺細(xì)胞NO的產(chǎn)生發(fā)揮作用。NIS受到多種因子的調(diào)控，如促甲狀腺維激素、全反式維甲酸、環(huán)磷酸腺苷 （cAMP）等可以上調(diào)NIS的表達(dá)，高碘、某些細(xì)胞因子及糖皮質(zhì)激素等則起到下調(diào)的作用［12］。某些細(xì)胞因子如IL-α及IL-β能夠刺激人甲狀腺細(xì)胞內(nèi)誘生性一氧化氮合酶（iNOS），其作用強(qiáng)而持久的NO［13］，這些細(xì)胞因子抑制碘攝取可能是通過NO介導(dǎo)，而夏枯草是否能抑制NOS仍需進(jìn)一步探討。研究表明，NO發(fā)揮其主要病理生理作用，是通過激活甲狀腺細(xì)胞鳥苷酸環(huán)化酶介導(dǎo)的cGMP生成這條途徑來實(shí)現(xiàn)［4］，研究也發(fā)現(xiàn)，cGMP類似物能抑制牛甲狀腺細(xì)胞碘的攝取［14］。甲狀腺細(xì)胞對(duì)碘的攝取是通過Na+-K+-ATP酶提供能量，NO已被證明能抑制甲狀腺細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶的活性［6］，夏枯草對(duì) Na+-K+-ATP酶的影響尚待進(jìn)一步證明。當(dāng)然，夏枯草對(duì)甲狀腺細(xì)胞碘攝取的影響可能存在多種機(jī)制，但NO在其中必定起重要作用?？傊?，深入研究夏枯草與甲狀腺之間的內(nèi)在聯(lián)系將有助于進(jìn)一步了解其藥理作用，為臨床治療甲狀腺相關(guān)疾病提供更為豐富的理論基礎(chǔ)。

［1］吳勝本.夏枯草口服液在Graves病治療中的應(yīng)用［J］.中成藥，2012，34（1）：10-11.

［2］張 靜，王 瑛，趙華棟，等.中藥夏枯草對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞系SW579增殖周期及凋亡的影響［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，11（23）：4434-4436.

［3］張王峰，付 強(qiáng)，趙華棟，等.中藥夏枯草對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞NIS基因表達(dá)及攝碘率的影響［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（9）：826-828.

［4］Esteves R Z，van Sande J，Dumont J E.Nitric oxide as a signal in thyroid［J］.Mol Cell Endocrinol，1992，90（1）：R1-R3.

［5］Bazzara L G，Vélez M L，Costamagna M E，et al.Nitric oxide/cGMP signaling inhibits TSH-stimulated iodide uptake and expression of thyroid peroxidase and thyroglobulin mRNA in FRTL-5 thyroid cells［J］.Thyroid，2007，17（8）：717-727.

［6］劉新宇，劉春娜，劉用璋，等.一氧化氮對(duì)人甲狀腺細(xì)胞鈉-碘轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響［J］.中國地方病學(xué)雜志，2004，23（3）：207-210.

［7］張麗丹，蘇 潔，呂圭源，等.夏枯草的藥理研究與臨床應(yīng)用［J］.海峽藥學(xué)，2011，23（5）：143-145.

［8］顧曉潔，錢士輝，李友賓，等.夏枯草的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國野生植物資源，2007，26（2）：5-7.

［9］劉新宇，劉春娜.一氧化氮對(duì)人甲狀腺細(xì)胞鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因調(diào)節(jié)作用［J］.中國藥房，2010，21（1）：28-29.

［10］劉新宇，劉春娜，劉用璋，等.一氧化氮供體硝普鈉對(duì)人甲狀腺細(xì)胞碘有機(jī)化的影響［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2006，22（2）：147-148.

［11］劉新宇，劉春娜.脂多糖對(duì)人甲狀腺細(xì)胞鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因調(diào)節(jié)作用［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2009，30（12）：1788-1789.

［12］Dohán O，De la Vieja A，Paroder V，et al.The sodium iodide symporter（NIS）：characterization，regulation，and medical significance［J］.Endocr Rev，2003，24（1）：48-77.

［13］van den Hove M F，Stoenoiu M S，Croizet K.et al.Nitric oxide is involved in interleukin-lα induced cytotoxicity in polarised human thyrocytes［J］.J Endocrinol，2002，173（1）：177-185.

［14］Costamagana M E，Cabanillas A M，Coleoni A H，et al.Nitric oxide donors inhibit iodide transport and organificafion and induce morphological changes in cultured bovine thyroid cells［J］.Thyroid，1998，8（12）：1127-1135.

R285.5

B

1001-1528（2013）05-1065-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.05.049

2012-08-30

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目 （2010225034），遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 （LT2010065）

劉新宇 （1976—），男，副教授，碩士，研究方向：中藥內(nèi)分泌。Tel：13504064376

*通信作者：劉春娜 （1977—），女，副教授，博士，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)。Tel：（0416）4673465，E-mail：springnanaliu@163.com夏枯草水提液能抑制甲狀腺細(xì)胞NO生成，提示增強(qiáng)甲狀腺細(xì)胞碘的攝取是通過抑制NO合成來實(shí)現(xiàn)的。關(guān)鍵詞：夏枯草；水提液；甲狀腺細(xì)胞；一氧化氮；鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)體；攝碘率；促甲狀腺激素