夏 冰 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院口腔科 杭州 310003

·實(shí)驗(yàn)研究·

不同濃度雌激素對(duì)人源性牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的影響

夏 冰 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院口腔科 杭州 310003

目的：對(duì)比研究不同濃度的雌激素對(duì)人源性牙周膜干細(xì)胞成骨分化的影響。方法：采用DMEM完全培養(yǎng)基將人牙周膜干細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，分別加入濃度為0、10×10-10、10×10-9、10×10-8、10×10-7、10×10-6、10×10-5mol/L的雌激素，以未加入雌激素的成骨誘導(dǎo)液組（普通DMEM培養(yǎng)基中加入10mM β-甘油磷酸鈉、50μM維生素C及10nM地塞米松）作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)后實(shí)時(shí)定量PCR方法分別檢測(cè)成骨早中晚期關(guān)鍵指標(biāo)Runx2、ALP和OCN mRNA表達(dá)。結(jié)果：濃度為10×10-10、10× 10-9、10×10-8、10×10-7、10×10-6、10×10-5mol/L的雌激素對(duì)人源性的牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)均無(wú)毒性；不同濃度組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在成骨誘導(dǎo)7、14、21天時(shí)，Runx2、ALP及OCN mRNA表達(dá)在10×10-7組最高（P＜0.05～0.01）。在不同濃度雌激素組中成骨相關(guān)基因的表達(dá)均高于陰性對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論：當(dāng)雌激素濃度＜10×10-7mol/L時(shí)，雌激素能夠以劑量依賴的方式促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中成骨相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng)雌激素濃度＞10×10-7mol/L時(shí)，雌激素濃度的增加并未促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。

牙周膜干細(xì)胞 成骨分化 雌激素

雌激素是骨骼系統(tǒng)中最為重要的調(diào)節(jié)因子，在調(diào)控女性骨骼新陳代謝方面發(fā)揮重要作用[1]，絕經(jīng)期婦女由于雌激素的缺乏容易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等疾病。牙槽骨是人類骨組織中代謝最為活躍的部位之一，極易受雌激素水平的影響，從而引發(fā)牙周疾病，進(jìn)而危害人類的口頜系統(tǒng)及身心健康。牙周膜干細(xì)胞是一類取自于牙周膜的間充質(zhì)來(lái)源的成體干細(xì)胞，由于其在特定的條件下可以分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成膠原細(xì)胞等，在維持牙周組織的穩(wěn)態(tài)，維護(hù)牙槽骨的新陳代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。本研究就不同濃度的雌激素對(duì)人源性牙周膜干細(xì)胞成骨分化的影響進(jìn)行了初步探討，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 人源性牙周膜干細(xì)胞來(lái)源 由第四軍醫(yī)大學(xué)牙體牙髓科嚴(yán)妍博士惠贈(zèng)[3]。

1.2 試劑及儀器 DMEM完全培養(yǎng)基（Gibico，美國(guó)），二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)，Thermo公司），相差倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本，Olympus公司），MTT（Sigma，美國(guó)），DMSO（Sigma，美國(guó)），β-甘油磷酸鈉（Sigma，美國(guó)），維生素C（Sigma，美國(guó)），地塞米松（Sigma，美國(guó)），Trizal（Invitrogen，美國(guó)），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金，中國(guó)），紫外分光光度計(jì)（Eppendorf，德國(guó)），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)，Rayto公司），UDG染料（全式金，中國(guó)），本實(shí)驗(yàn)所采用的引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 人源性牙周膜干細(xì)胞取材及培養(yǎng) 采用含有10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清（Gibico，美國(guó)）的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、含5%CO2、相對(duì)濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察牙周膜干細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞鋪滿瓶底大約90%時(shí)，采用0.25%的胰酶消化后，將消化的人牙周膜干細(xì)胞以1:3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第四代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 不同濃度雌激素對(duì)人源性牙周膜干細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn) DMEM完全培養(yǎng)基將人牙周膜干細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以每孔8×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積約200μL。培養(yǎng)基中分別加入濃度為0、10×10-10、10×10-9、10×10-8、10×10-7、10×10-6、10×10-5mol/L的雌激素分別培養(yǎng)48、96h后棄培養(yǎng)基，每孔中加入100μL MTT溶液，37℃溫箱孵育6h后終止培養(yǎng)，棄上清液。每孔加入150μL DMSO，震蕩使結(jié)晶物充分溶解后，酶標(biāo)儀檢測(cè)。

2.3 不同濃度雌激素對(duì)人源性牙周膜干細(xì)胞成骨的分化誘導(dǎo) 將細(xì)胞懸液以每皿3×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 cm培養(yǎng)皿中，成骨誘導(dǎo)液中分別加入濃度為10×10-10、10×10-9、10×10-8、10×10-7、10×10-6、10×10-5mol/L的雌激素。以未加入雌激素的成骨誘導(dǎo)液組（普通DMEM培養(yǎng)基中加入10mM β-甘油磷酸鈉、50μM維生素C及10nM地塞米松）作為陰性對(duì)照。每3天換1次液。分別培養(yǎng)7、14、21天。

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)成骨不同階段的關(guān)鍵指標(biāo)Runx2、ALP和OCN的mRNA表達(dá) 于7、14、21天分別收取細(xì)胞，以Trizal提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其含量和純度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將其以1: 10倍稀釋待用。PCR反應(yīng)引物（由上海生物工程技術(shù)有限公司合成）：18S：上游5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3’，下游5’-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’；Runx2：上游5’-TGGTTACTGTCATGGCGGGTA-3’，下游5’-TCTCAGATCGTTGAACCTTGCTA-3’；ALP：上游5’-GGGACTGGTACTCAGACAACG-3’，下游5’-GTAGGCGATGTCCTTACAGCC-3’；OCN：上游5’-GGCGCTACCTGTATCAATGG-3’，下游5’-GTGGTCAGCCAACTCGTCA-3’?？偡磻?yīng)體系20μL，其中模板cDNA 2μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，反應(yīng)液10μL，ddH2O 8μL，反應(yīng)條件為：50℃2min，95℃2min，95℃15s，60℃1min，循環(huán)40次。以18S為內(nèi)參。以上實(shí)驗(yàn)采用不同的原代標(biāo)本重復(fù)3次取均值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析，以P＜0.05為有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 人牙周膜干細(xì)胞的特性 倒置顯微鏡下觀察，牙周膜干細(xì)胞多呈長(zhǎng)梭形，有1～2個(gè)突起。細(xì)胞核為卵圓形，位于細(xì)胞質(zhì)的中央。形態(tài)與成纖維樣細(xì)胞類似。少數(shù)細(xì)胞形態(tài)為不規(guī)則的多角形、紡錘狀或橢圓形，體積較小，胞體豐滿。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)良好。

3.2 不同濃度雌激素的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 雌激素能夠調(diào)控小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與分化[4]，所以首先本實(shí)驗(yàn)采用MTT的方法檢測(cè)不同濃度的雌激素對(duì)人源性牙周膜干細(xì)胞的細(xì)胞毒性，實(shí)驗(yàn)中所采用的濃度為10×10-10、10×10-9、10×10-8、10×10-7、10×10-6、10×10-5mol/L的雌激素對(duì)人源性的牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)均無(wú)毒性。不同濃度組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度雌激素處理人牙周膜干細(xì)胞48h、96h后細(xì)胞活性

3.3 不同濃度雌激素對(duì)人源性牙周膜干細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)第7、14、21天，標(biāo)志著成骨不同階段的關(guān)鍵指標(biāo)Runx2、ALP及OCN的基因表達(dá)水平相對(duì)于DMEM對(duì)照組顯著上升。在成骨誘導(dǎo)7、14、21天時(shí)，成骨相關(guān)基因Runx2、ALP及OCN的基因水平表達(dá)在10×10-7組表達(dá)量最高（aP＜0.05，bcP＜0.01）。在不同濃度雌激素組中成骨相關(guān)基因的表達(dá)均高于陰性對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度雌激素處理牙周膜干細(xì)胞7、14、21天后，Runx2、ALP及OCN mRNA表達(dá)，與0mol/L組比較，aP＜0.05，b、cP＜0.01

4 討論

牙周病是一類發(fā)生于牙槽骨的炎癥性骨吸收疾病，是造成牙齒松動(dòng)、牙列缺失及缺損的主要原因，影響了世界上大約20%人口的口頜系統(tǒng)健康[5]。嚴(yán)重的牙周炎癥得不到有效控制，會(huì)造成牙槽骨及根尖周組織的不可逆性損害，從而危害人類的口頜系統(tǒng)乃至身心健康。牙周膜干細(xì)胞是一類來(lái)自于牙周膜的成體干細(xì)胞，它不同于胚胎干細(xì)胞等涉及到倫理等敏感問(wèn)題，同時(shí)卻具有類似于胚胎干細(xì)胞的多向分化潛能，在牙槽骨及牙周組織的再生修復(fù)過(guò)程中顯示了巨大的潛力[6]。

由于牙周膜干細(xì)胞能夠同時(shí)表達(dá)ERα和ERβ受體，所以它被廣泛認(rèn)為屬于雌激素的一個(gè)靶器官。在大鼠的卵巢切除模型中，雌激素能夠通過(guò)與雌激素受體相互作用促進(jìn)鼠源性牙周膜干細(xì)胞的成骨分化[7]。此外，雌激素還能夠通過(guò)劑量依賴效應(yīng)促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[4]。除卻雌激素外，許多類雌激素功能的黃酮類物質(zhì)，例如染料木堿（一類黃酮類類雌激素物質(zhì)）、柚皮素的衍生物（naringenin-6-C-glucoside（NCG））、TAK78等同樣能夠模仿雌激素的生理功能促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨向分化[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，10×10-10～10×10-5mol/L濃度的雌激素對(duì)人牙周膜干細(xì)胞無(wú)毒性。成骨誘導(dǎo)過(guò)程中外源性雌激素的加入能夠上調(diào)成骨相關(guān)指標(biāo)Runx2、ALP和OCNmRNA的表達(dá)。

牙周膜干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化過(guò)程受一系列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子控制。其中Runx2是調(diào)控成骨分化過(guò)程中最關(guān)鍵的調(diào)控因子，它對(duì)成骨細(xì)胞的分化、成熟和骨的形成有著決定的作用[11]。Runx2不僅是成骨分化過(guò)程中最先表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它還能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子osterix以及骨形成相關(guān)基因，如I型膠原酶、ALP、骨涎蛋白、骨形成蛋白、OCN等的表達(dá)[11-13]。除此之外，ALP和OCN等骨形成相關(guān)基因在骨基質(zhì)的礦化、成熟方面也發(fā)揮了重要作用[14]。為了研究不同濃度雌激素對(duì)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的影響，本研究選取檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)Runx2、ALP和OCN的變化。發(fā)現(xiàn)Runx2的表達(dá)量在第7天達(dá)到峰值，ALP和OCN分別在第14天和第21天達(dá)到峰值。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度＜10×10-7mol/L時(shí)，雌激素能夠以劑量依賴的方式促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中成骨相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng)濃度＞10×10-7mol/L時(shí)，雌激素濃度的增加并未促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。朱曉斐等[4]研究發(fā)現(xiàn)雌激素能夠通過(guò)劑量依賴效應(yīng)促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，本研究結(jié)果與之基本一致。在后期的研究中，我們將進(jìn)一步對(duì)雌激素促進(jìn)人牙周干細(xì)胞的成骨分化機(jī)制進(jìn)行探討，為臨床中由于雌激素缺乏引起的牙周疾病的治療提供理論依據(jù)。

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Effect of Estrogen on Osteogenic Differentiation of Human Periodontal Ligament stem cells

XIA Bing.Hangzhou Red Cross Hospital，Hangzhou（310003），China

Objective：To compare the effect of estrogen with different concentrations on osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells.Methods:Human periodontal ligament stem cell suspension was prepared with DMEM complete medium and then were cocultured with 0，10×10-10，10×10-9，10×10-8，10×10-7，10×10-6，and 10× 10-5mol/L of estrogen.Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of osteogenic key indicators like Runx2，ALP，and OCN mRNA after coculture.Results：No toxic effect on human periodontal ligament stem cells was found in 10×10-10，10×10-9，10×10-8，10×10-7，10×10-6，and 10×10-5mol/L estrogen groups and no statistically significant difference was noted among these groups（P＞0.05）.On day 7，14，and 21 during osteogenic differentiation，the expression of Runx2，ALP，and OCN mRNA were the highest in 10×10-7estrogen group（P＜0.05～0.01）and were higher in all estrogen groups compared with the negative control group（0 estrogen group，P＜0.05）.Conclusion：Estrogen can promote bone-related gene expressions during osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells in a dose-dependent manner when its concentration was not more than 10×10-7mol/L.When estrogen levels were more than 10×10-7mol/L，the effect was not seen.

periodontal ligament stem cells osteogenic differentiation estrogen

2013-07-30