楊 棟 王 瑋 張永玲

1.河南省鄭州人民醫(yī)院，河南鄭州 450000；2.河南大學藥學院，河南開封 475000

鹽酸氟桂利嗪（flunarizine hydrochloride，F(xiàn)NZ）化學名為（E）-1-[雙（4-氟苯基）甲基]-4-2（2-丙烯基-3-苯基）-哌嗪二鹽酸鹽。類別：血管擴張藥。性狀：本品為白色或類白色結晶或結晶性粉末；無臭；無味。本品是一種鈣離子通道阻斷劑[1]，能防止因缺血等原因導致的細胞內病理性鈣超載而造成的細胞損害，適用于腦動脈硬化、腦血栓形成、高血壓所致的腦循環(huán)障礙、腦出血、頭部外傷及其后遺癥。固體脂質納米粒（SLN）結合了聚合物膠束和水包油性脂質納米乳的優(yōu)點[2]，同時避免了這兩種的缺點，因此是一種特別具有潛力的藥物載體[3]。本實驗采用鹽酸氟桂利嗪作為包封對象，通過溶劑乳化冷卻固化法制備鹽酸氟桂利嗪固體脂質納米粒，以達到對腦的靶向作用。對于載藥固體脂質納米粒包封率的測定，涉及到游離藥物與固體脂質納米粒的分離。常見的分離方法主要有透析法﹑離心法和葡聚糖凝膠法等。影響包封率的因素很多，如藥物-類脂比﹑類脂的種類﹑藥物的性質及制備方法等[4]。所以包封的藥物不同，固體脂質納米粒的種類及所用脂質材料不同，適宜采用的測定方法亦不相同。本次實驗旨在采用這三種常見的分離方法進行分離，并從中尋找到對于鹽酸氟桂利嗪固體脂質納米粒及其游離藥物分離的較好方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

0516-1臺式離心機 （上海醫(yī)療器械有限公司），CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器 （鄭州長城科工貿有限公司），JY92-ⅡN超聲波細胞粉碎機 （寧波新芝科技股份有限公司），S-250D超聲波清洗器 （寧波科生儀器廠），P230型高效液相色譜儀（大連依利特公司），EC2000色譜工作站（大連依利特分析儀器有限公司），AT-330柱恒溫箱 （天津奧特賽恩斯儀器有限公司），色譜柱：ODS-C18柱（200 mm×4.6 mm，大連依利特分析儀器有限公司），透析袋（北京科百奧生物科技有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸氟桂利嗪 （鄭州康瑞制藥有限公司，批號：20111002），豆磷脂（上海恒信化學試劑有限公司，批號：20091115），硬脂酸（浙江日用海鹽化工廠，批號：20100301），Poloxamer188（南京威爾化工有限公司，批號：20111107），SephadexG-50（北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司，批號：20091017），甲醇（天津市福晨化學試劑廠，色譜純）。

2 方法與結果

2.1 鹽酸氟桂利嗪固體脂質納米粒的制備

采用溶劑乳化冷卻固化法制備鹽酸氟桂利嗪固體脂質納米粒。將處方量Poloxamer188在（75±3）℃下分散均勻制成水相；在相同溫度下將豆磷脂、鹽酸氟桂利嗪和硬脂酸分別溶解于無水乙醇和二氯甲烷中，然后將兩者混合均勻成有機相；將有機相逐滴加入水相中，此過程中保持水浴溫度在（75±3）℃及水相的攪拌速度為1 000 r/min。然后在該溫度下將其混合后的溶液濃縮至8 mL，將濃縮液快速加入另一0℃的水相中，然后經超聲波細胞粉碎機超聲后即制得分散均勻的鹽酸氟桂利嗪固體脂質納米粒混懸液[5]。

2.2 色譜條件

色譜柱：ODS-C18（200 mm×4.6 mm）；流動相：甲醇-磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀1.36 g，加水溶解稀釋成1 000 mL，加三乙胺 4 mL，用磷酸調 pH 值至 3.5）（75︰25）[1]；流速：1.0 mL/min；檢測波長：253 nm；柱溫：30 ℃，進樣量：20 μL。

2.3 標準曲線的繪制

分別精密吸取濃度為20 μg/mL的FNZ貯備液0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL 置 于 10.0 mL 容 量 瓶中，以甲醇定容至刻度，搖勻，得濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 μg/mL 的系列溶液。 在“2.2”項色譜條件下分別取上述標準系列溶液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積。以鹽酸氟桂利嗪峰面積（A）對鹽酸氟桂利嗪濃度（C）進行線性回歸?；貧w方程為：A=43.565C+0.5811（r=0.9997）。 即鹽酸氟桂利嗪在 0.1～5.0 μg/mL 范圍內，峰面積（A）與測定濃度（C）呈良好的線性關系。

2.4 精密度試驗

精密量取濃度為20 μg/mL的FNZ貯備液適量，分別用流動相稀釋成濃度為1.0、3.0、5.0 μg/mL的溶液，在一天內每隔2小時進樣1次，共測定3次，將測得的峰面積代入回歸方程計算，RSD值分別為1.42%、1.83%、0.60%，表明精密度良好。

2.5 加樣回收率試驗

精密量取濃度為20 μg/mL的FNZ貯備液適量，分別加入適量的空白SLN，用流動相溶解并定容，得到濃度分別為 1.0、3.0、5.0 μg/mL 的溶液，進樣 20 μL，將測得的峰面積代入回歸方程，計算平均回收率為98.56%，RSD值為1.76。

2.6 鹽酸氟桂利嗪固體脂質納米粒包封率的測定

2.6.1 透析法

精密吸取鹽酸氟桂利嗪固體脂質納米粒混懸液2.0 mL，置透析袋中封口，取蒸餾水28 mL做透析袋外液，室溫下透析6 h，達平衡后取透析袋外液2.0 mL定容至5.0 mL容量瓶中，搖勻[6]。精密吸取 20 μL 溶液，進樣，按“2.2”項下色譜條件測定游離鹽酸氟桂利嗪濃度，計為M1；另精密吸取鹽酸氟桂利嗪固體脂質納米?；鞈乙?.0 mL，用甲醇破乳并定容至10.0 mL容量瓶中，同法測定鹽酸氟桂利嗪總濃度， 計為 M2；計算平均包封率為 76.42%[（M2-M1）/M1×100%]，RSD 值為 1.75%（n=3）。

2.6.2 離心法

（1）精密量取FNZ-SLN混懸液 2.0 mL，15 000 r/min離心30 min，精密量取上清液0.5 mL于5 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，測FNZ的含量C1。（2）精密吸取0.5 mL的FNZ-SLN混懸液，轉入5 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解，用甲醇定容至刻度，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液測定FNZ的含量C2[7]。離心法包封率計算公式如下：包封率（%）=（1－C1/C2）×100%。 由于載藥脂質硬脂酸密度與水相近，離心難度大，即使離心較長時間后，離心管上清液中仍有白色的FNZ-SLN，不能完全將FNZ-SLN沉降至管底，即很難把FNZ-SLN與游離FNZ分離完全，測定結果為 46.37%，RSD 值為 3.26%（n=3）。

2.6.3 葡聚糖凝膠法

2.6.3.1 洗脫曲線的考察 取一定量Sephadex G-50，用30%的乙醇溶脹12 h后，裝入到20 cm×1.0 cm的層析柱中，最終得到柱高為（15.0±0.5）cm的葡聚糖凝膠柱。取空白SLN 2 mL上柱，用30%乙醇洗脫，飽和柱子后，再分別精密吸取FNZ-SLN 0.3 mL上柱，用30%乙醇洗脫，流速1.0 mL/min，每2分鐘分段收集洗脫液，然后把收集到的洗脫液分別加入到10 mL容量瓶中，先用適量甲醇溶解，后用甲醇定容，取20 μL進樣測定，記錄色譜圖，代入線性回歸方程算出濃度，做洗脫曲線[7-8]，如圖1。結果表明，葡聚糖凝膠柱可將FNZ-SLN和游離藥物完全分開，即此法適合本實驗的要求，所以選用葡聚糖凝膠法作為包封率的測定方法。

圖1 FNZ-SLN在Sephadex G-50中的洗脫曲線

2.6.3.2 柱回收率測定 以蒸餾水與30%乙醇溶液作為洗脫液，洗脫飽和過的柱子的回收率為（93.60±1.85）%。

2.6.3.3 包封率的測定 精密吸取空白固體脂質納米粒混懸液1.0 mL上柱，飽和柱子后，分別精密吸取三批鹽酸氟桂利嗪固體脂質納米?；鞈乙?.3 mL，按“2.6.3.2”項下方法進行試驗，測定游離藥物濃度；另精密吸取含藥固體脂質納米?；鞈乙?.0 mL于10.0 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。按“2.2”項下色譜條件測定總藥物濃度，計算包封率。結果見表1?？梢灾暇厶悄z法的包封率為（79.20±1.27）%，RSD 值為 1.61%。 由此可以看出 FNZ-SLN使用葡聚糖凝膠法測定包封率時，結果RSD值較小，說明該方法較精密，由圖1看出該法的分離度也較好，所以葡聚糖凝膠法比較適合鹽酸氟桂利嗪固體脂質納米粒和其游離藥物的分離。3結論

表1 FNZ-SLN包封率測定結果（n=3）

通過比較透析法、離心法和葡聚糖凝膠法這三種方法，最終選定葡聚糖凝膠法作為鹽酸氟桂利嗪固體脂質納米粒與其游離藥物的適宜分離方法，該法相對于離心法對儀器設備的要求較低，且分離效果較好，相對于透析法則耗時較短且測定的結果較準確。所以對于鹽酸氟桂利嗪固體脂質納米粒來說，葡聚糖凝膠法是適宜的包封率測定方法，用該方法測得其包封率為（79.20±1.27）%。

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