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        人胚腎293細胞中乙酰轉(zhuǎn)移酶p300對二甲基精氨酸二甲胺水解酶2基因表達的調(diào)節(jié)*

        2013-05-23 07:31:40李英慧李家亓孫陸初國銘孫志軍
        中國循環(huán)雜志 2013年1期
        關鍵詞:突變型乙?;?/a>一氧化氮

        李英慧,李家亓,孫陸,初國銘,孫志軍

        一氧化氮(NO)具有舒張血管、抗血小板黏附與聚集等功能,同時它在腎單位的不同部位發(fā)揮促進尿鈉排泄的作用[1-6],腎臟的一氧化氮生物效應降低是高血壓的重要特征之一[7]。一氧化氮由三種一氧化氮合酶(NOS)催化合成,包括:神經(jīng)型(nNOS)、誘導型(iNOS)和內(nèi)皮型(eNOS)。非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)是三種一氧化氮合酶的共同內(nèi)源性抑制劑,在體內(nèi)ADMA主要由二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)降解。多種心血管危險因素可通過降低DDAH活性影響一氧化氮合酶和一氧化氮作用,從而參與高血壓發(fā)生和發(fā)展[8-10]。因此,NOS和DDAH/ADMA系統(tǒng)是調(diào)節(jié)組織一氧化氮水平從而參與血壓調(diào)節(jié)的兩個重要方面。DDAH分為兩種亞型(DDAH1和DDAH2),DDAH2在調(diào)節(jié)ADMA代謝中發(fā)揮更為重要的作用。

        乙?;瘏⑴c調(diào)節(jié)多種基因表達,p300是一種重要的乙酰轉(zhuǎn)移酶。我們的研究及其他報道顯示,p300介導的乙?;瘏⑴c三種一氧化氮合酶基因的表達調(diào)控[11,12],迄今為止尚少見有關乙酰化對 DDAH基因表達調(diào)節(jié)的報道,本研究旨在探討p300是否亦參與調(diào)節(jié)DDAH2基因的表達。我們以人胚腎HEK293細胞為研究對象,通過轉(zhuǎn)染野生型及乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)結構域缺失的突變型p300表達載體,檢測DDAH2基因表達水平及啟動子活性變化,從而探討人胚腎HEK293細胞中乙?;瘜DAH2表達的調(diào)控作用。

        1 材料和方法

        細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:實驗時間:2010-03至2011-06選取人胚腎HEK293細胞(來自中國科學院上海生命科學研究院)在DMEM培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 μg/ml鏈霉素,美國 GIBCO 公司)、37℃、5%CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)。0.25%的胰酶(生理鹽水配制)消化傳代。轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)基更換為無血清無抗生素培養(yǎng)基,應用 LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染野生型或乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)結構域缺失的突變型p300 表達載體(Margottin-Goguet教授惠贈[13]),6 h 后更換為常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞待用。

        Western blot雜交:單去污裂解液方法提取細胞總蛋白,煮沸后上樣至十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,室溫封閉。分別以1∶1000稀釋的兔p300或β-肌動蛋白(βactin)多克隆抗體(購自美國Santa Cruz公司)為一抗進行雜交過夜,洗膜后加入1∶3000稀釋的山羊抗兔IgG作為二抗,室溫雜交2 h?;瘜W發(fā)光法檢測雜交信號。

        實時定量聚合酶鏈式反應(real-time PCR):TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)常規(guī)方法提取細胞核糖核酸(RNA),應用DNAase I消化殘留 DNA,使用美國Promega公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒應用隨機引物法合成編碼脫氧核糖核酸(cDNA)。應用 SYBR Green(日本TaKaRa公司)染料法,以β-actin為內(nèi)參,采用相對定量方法進行real-time聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。DDAH2特異性引物序列為:上游5'-TCCCTTCTCCACCAACTCTG-3',下游 5'-CAACCGCTCGGATTTCTTAG-3';β-actin特異性引物序列為:上游5'-CCCAGAGCAAGAGAGGCA-3',下游 5'-GGGAGCCACACGCAG-3'。在優(yōu)化條件下應用AB公司7500型熒光定量PCR儀進行real-time PCR擴增,每個樣品重復擴增三次,每次設置三復孔,取平均值作為相對表達量。

        DDAH2動子結構分析及載體構建:應用TRANSFAC-TESS及 Alibaba軟件分析 DDAH2啟動子區(qū)593bp(-530~+63)序列,預測其中是否存在受乙?;{(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子結合位點。確定轉(zhuǎn)錄起始位點為+1,將+44~+63定為下游引物,上游引物分別于-530~-510,-171~151處,以人基因組DNA為模板,不同的PCR反應條件下進行擴增,膠回收純化后,將片段克隆至pMD18-T克隆載體,酶切鑒定。使用HindIII和KpnI雙酶切所得載體及熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic(美國Promega公司),應用T4 DNA連接酶將酶切獲得的不同長度DDAH2啟動子序列連接于pGL3-Basic載體上,進行測序鑒定。所得載體分別命名為pGL530w和pGL171w應用美國Axygen公司質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒。

        熒光素酶報告基因活性檢測:24孔培養(yǎng)皿中接種 HEK293 細 胞,37℃ 培 養(yǎng) 24 h,應用LipofectamineTM2000將pGL530w DNA或pGL171w DNA及對照pRL-TK質(zhì)粒DNA(美國Promega公司)轉(zhuǎn)染至細胞,同時共轉(zhuǎn)染野生型或突變型p300表達載體。應用Promega公司DUAL-GLOTM雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測啟動子活性,將pGL530w或pGL171w與pRL-TK活性比值作為啟動子相對活性。每個樣品重復三次,取平均值。

        統(tǒng)計分析:使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,應用t檢驗判斷組間差異,以確定組間差異是否具有顯著性。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        p300對DDAH2 mRNA表達水平的影響:①應用Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效果,結果如圖1所示,轉(zhuǎn)染野生型和突變型p300表達載體的細胞中p300蛋白表達水平顯著提高(P<0.05)。②應用real-time PCR方法檢測了p300對DDAH2 mRNA表達水平的影響,結果顯示野生型p300可顯著提高DDAH2 mRNA表達,與對照比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而轉(zhuǎn)染HAT結構域缺失的突變型p300載體的細胞中DDAH2 mRNA表達,與對照比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2)。

        DDAH2啟動子熒光素酶基因報告基因載體的構建:為鑒定DDAH2啟動子活性,首先應用TRANSFACTESS及Alibaba軟件分析了DDAH2啟動子結構,發(fā)現(xiàn)其中存在多種潛在的受乙酰化調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子結合位點,如核因子-κB(NF-κB)、CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBP)、特異性蛋白1(Sp1)等。

        根據(jù)預測到的反應元件的位置,我們構建了兩個DDAH2啟動子熒光素酶報告基因載體,分別包含DDAH2啟動子-530~+63及-171~+63區(qū)域,命名為pGL530w和pGL171w(二者結構如圖3所示),并經(jīng)測序鑒定。

        p300對DDAH2啟動子活性的作用:應用雙熒光素酶檢測系統(tǒng),我們分析了DDAH2啟動子活性。結果顯示,基礎條件下,pGL530w和pGL171w均存在較高的活性,轉(zhuǎn)染野生型p300表達載體可顯著提高二者活性,與對照(未處理細胞)相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但突變型p300對二者活性的作用與對照比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖4)。

        圖1 Western blot結果顯示表達載體轉(zhuǎn)染后p300蛋白表達情況。β-actin:β-肌動蛋白 wt-p300:轉(zhuǎn)染野生型 p300表達載體;mut-p300:轉(zhuǎn)染突變型p300表達載體 對照:未處理細胞

        圖2 實時定量聚合酶鏈式反應(real-time PCR)結果顯示不同條件下DDAH2 mRNA表達水平。與對照(未處理細胞)比較*P<0.05。圖示三次實驗均值±標準差;△:以 DDAH2與β-actin mRNA表達量比值作為DDAH2 mRNA相對表達量,每個樣品重復擴增三次,每次設置三復孔,取平均值。DDAH2:二甲基精氨酸二甲胺水解酶,余注見圖1

        圖3 兩個DDAH2啟動子熒光素酶報告基因載體結構示意圖

        圖4 熒光素酶結果顯示不同條件下DDAH2啟動子活性。與對照(未處理細胞)比較*P<0.05。圖示三次實驗均值±標準差?!?將pGL530w或pGL171w與pRL-TK活性比值作為相對熒光素酶活性,每個樣品重復三次,取平均值,余注見圖1

        3 討論

        蛋白質(zhì)乙?;且环N生物體內(nèi)廣泛存在的表觀遺傳學修飾。多種蛋白質(zhì)(主要包括組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子)可進行乙酰化修飾,它們在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達。蛋白質(zhì)的乙?;街饕軆深惷傅恼{(diào)節(jié),即組蛋白HAT和組蛋白去乙?;?HDAC)。HAT將乙酰輔酶A的乙酰基團轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)特定賴氨酸殘基而引起蛋白質(zhì)乙?;?,HDAC與其作用相反。目前已發(fā)現(xiàn)多種高血壓相關基因受乙酰化的調(diào)節(jié),例如WNK4(一種鈉離子重吸收的調(diào)節(jié)因子)基因是一種重要的高血壓候選基因,研究顯示刺激β(2)腎上腺素受體可導致腎臟中AMP依賴的組蛋白去乙?;?(HDAC8)活性的抑制,而引起組蛋白乙酰化,增強糖皮質(zhì)激素受體與WNK4啟動子的一個負性糖皮質(zhì)激素受體反應元件結合,導致WNK4表達抑制,其可能在鹽敏感性高血壓發(fā)生中具有重要意義[14]。同時有研究顯示乙酰化在神經(jīng)系統(tǒng)對血壓的調(diào)節(jié)中亦有重要意義,例如褪黑素在神經(jīng)膠質(zhì)細胞及神經(jīng)干細胞中可引起組蛋白乙?;?,從而調(diào)節(jié)多種基因的表達,而腦干中血管舒張調(diào)節(jié)區(qū)表達高水平的褪黑素受體[15]。因此,乙?;驯徽J為是一種重要的潛在的高血壓治療靶點。

        一些轉(zhuǎn)錄輔激活因子已被證實具有乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性,包括 p300、PCAF、GCN5 等[16,17]。p300 是研究的最為深入的具有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的輔激活因子之一,它是一種具有多個重要結構域的大分子蛋白質(zhì),其中包括一個重要的HAT結構域,它可以催化所有四種核心組蛋白N末端的賴氨酸殘基和許多其他非組蛋白的乙酰化,并且這種乙酰化功能對p300在一些基因中的轉(zhuǎn)錄激活功能是必需的[18]。例如與野生型p300相比,HAT功能域缺失的p300不能使iNOS基因表達上調(diào)[10]。因此,為鑒定乙?;瘜DAH2基因表達的影響,我們分別轉(zhuǎn)染了野生型及HAT結構域缺失的突變型p300表達載體,real-time PCR結果顯示野生型p300顯著上調(diào)DDAH2 mRNA表達水平,而突變型p300無此作用,提示p300對DDAH2的表達上調(diào)依賴于HAT結構域,說明p300可能通過乙?;承┑鞍踪|(zhì)而上調(diào)DDAH2 mRNA水平。同時我們注意到突變型p300可使DDAH2 mRNA水平輕度下調(diào),這可能是由于外源的突變型p300競爭性抑制了內(nèi)源性p300與某些轉(zhuǎn)錄相關蛋白的結合及其乙酰轉(zhuǎn)移酶的功能,而影響了DDAH2的轉(zhuǎn)錄。

        同時,為進一步鑒定乙?;{(diào)節(jié)DDAH2表達的機制,我們應用軟件分析了DDAH2啟動子結構,結果發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)存在多種受乙?;{(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子結合位點,包括 NF-κB、Sp1、C/EBP 等,提示 p300 可能通過乙酰化這些轉(zhuǎn)錄因子及組蛋白,而影響啟動子活性,從而調(diào)節(jié)DDAH2基因表達。因此我們構建了兩個DDAH2啟動子熒光素酶報告基因載體,與p300表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293細胞后,檢測熒光素酶活性。結果顯示,野生型p300可顯著上調(diào)啟動子活性,而缺失HAT結構域的p300作用不明顯,提示p300對DDAH2啟動子的作用依賴于其HAT結構域,提示它通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的乙?;{(diào)節(jié)啟動子活性,進一步說明了乙酰化在DDAH2基因表達調(diào)控中的作用。

        綜上,我們的結果顯示腎臟細胞中p300介導的乙?;赏ㄟ^調(diào)節(jié)DDAH2基因啟動子活性,從而參與調(diào)節(jié)DDAH2基因表達。我們的結果及從前的報道證明p300—乙?;緩酵瑫r調(diào)節(jié)NOS及DDAH/ADMA系統(tǒng),因此其可能在組織NO生物合成種發(fā)揮重要作用,從而參與調(diào)節(jié)血壓水平,這有可能為尋找新的高血壓發(fā)生的分子機制提供一定的理論基礎,并為其治療提供新的分子靶標。

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