文昱婷 朱穎 楊旸 楊健 張秀偉

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，在工業(yè)發(fā)達(dá)國家，肺癌發(fā)病率已位居各種惡性腫瘤的首位。一項我國惡性腫瘤死亡率回顧性研究表明，惡性腫瘤死亡率呈上升趨勢，目前，肺癌成為我國男性和女性惡性腫瘤的頭號殺手［1-2］。肺癌是一種基因性疾病，癌基因的激活或者抑癌基因的失活導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和凋亡障礙，是肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。survivin于1997年被發(fā)現(xiàn)，是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和程序性死亡的蛋白，在大多數(shù)腫瘤中高表達(dá)，且研究發(fā)現(xiàn)survivin在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，成為目前肺癌研究領(lǐng)域的一個新熱點［3-4］。NSCLC患者胸腔積液的出現(xiàn)通常意味著疾病的嚴(yán)重性和患者較短的生存期，惡性胸腔積液的早期診斷與肺癌的治療及預(yù)后關(guān)系密切，且不同的病理類型對治療的反應(yīng)各不相同。尋找胸腔積液中高敏感性、高準(zhǔn)確性的標(biāo)志物來早期診斷良、惡性胸水仍然是臨床研究的熱點。本研究通過western blot法研究NSCLC惡性胸腔積液中survivin的表達(dá)情況及其與相關(guān)臨床特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2011年1月至2012年6月在我院確診惡性胸腔積液48例，其中男32例，女16例，年齡51～89歲，中位年齡為68歲，均經(jīng)胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)、纖維支氣管鏡病理活檢或經(jīng)皮肺穿刺細(xì)胞學(xué)等方法得到病理學(xué)證實為NSCLC患者。組織學(xué)分型，腺癌患者41例，鱗癌患者7例。均為初診患者。所有病例排除其他癌癥，采取標(biāo)本之前未行抗癌治療。對照組30例，男24例，女6例，年齡24～80歲，中位年齡為59歲。其中結(jié)核性胸膜炎14例，肺炎旁胸腔積液及膿胸8例，心功能不全8例。

1.2 試劑與方法

1.2.1 一抗:Rabbit polyclonal anti-survivin購自美國Santa Cruz公司;二抗:IRDyeTM800 Conjugated anti-Rabbit/Mouse second antibody購自美國 Rockland公司。

1.2.2 標(biāo)本的處理:取胸腔積液標(biāo)本200～400 ml，恒溫離心，3000 r/min，10 min，收集沉淀細(xì)胞，如血性標(biāo)本用低滲氯化銨溶液去除紅細(xì)胞。取部分沉淀細(xì)胞涂片，涂片經(jīng)預(yù)冷丙酮固定干燥后置于－20℃冰箱保存待測。

1.2.3 western blot法:?。?0℃保存的沉淀細(xì)胞，預(yù)冷PBs洗3次，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。用Bradford法行總蛋白定量。調(diào)整每個泳道上樣量為20 μg左右。聚丙烯酰胺凝膠電泳:采用5%積層膠和10%分離膠;積層膠電泳電壓為60 V，分離膠電泳電壓為120 V，總計電泳時間為2 h左右。脫脂牛奶封閉PVDF膜，蛋白上樣量分別為50 μg，一抗(Rabbit polyclonal anti-MACC-1)濃度為1∶400，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(二抗?jié)舛葹?∶400)結(jié)合，ECL試劑發(fā)光，X膠片曝光，顯影、定影，將條帶掃描進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC惡性胸腔積液與對照組survivin蛋白水平比較 48例NSCLC患者惡性胸腔積液中，survivin陽性表達(dá)為 37例，陰性表達(dá)為 11例，陽性率為77.08%。在對照組中無 survivin陽性表達(dá)者。見圖1。

2.2 不同性別、病理類型的NSCLC患者惡性胸腔積液survivin表達(dá)比較 在survivin陽性表達(dá)的37例中，腺癌和鱗癌的陽性表達(dá)例數(shù)分別為33例(80.49%)和 4例(57.14%)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。男性和女性的陽性表達(dá)例數(shù)分別為27例(84.38%)10例(62.50%)，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.3 NSCLC患者惡性胸腔積液中survivin表達(dá)對預(yù)后的影響 在隨訪周期內(nèi)采用門診復(fù)查和電話相結(jié)合的方式進(jìn)行隨訪，其終點為病變進(jìn)展或死亡。結(jié)果顯示，survivin陽性表達(dá)者預(yù)后明顯不佳(P＜0.01)。見表1。

表1 NSCLC患者惡性胸腔積液中survivin表達(dá)與臨床特征關(guān)系

3 討論

導(dǎo)致胸腔積液的原因很多，常見原因有原發(fā)性肺癌、肺結(jié)核等多種疾病，近年來，肺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，惡性胸腔積液明顯增多，尤以肺腺癌更易發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移。胸腔積液的良、惡性鑒別要依靠細(xì)胞學(xué)檢查，但其敏感性低、難以滿足臨床需要。因此需要尋求新的診斷方法，胸腔積液中腫瘤標(biāo)志物的檢測成為了肺癌診斷和鑒別診斷的重要手段。

survivin具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的雙重功能，能抑制 Fas、bax及caspase-7和化療藥誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［5］。survivin的基本作用之一是抑制細(xì)胞凋亡，同時參與有絲分裂的調(diào)控［6］，且僅在有絲分裂過程中表達(dá)。免疫組化研究結(jié)果已經(jīng)證明survivin可能存在于人類多種腫瘤細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，其在腫瘤細(xì)胞核中的表達(dá)顯示臨床預(yù)后不佳［7］。在正常生理條件下survivin的表達(dá)局限于胚胎、造血、上皮細(xì)胞和性腺細(xì)胞系。但在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)survivin高表達(dá)，包括96%的肺癌、100%的結(jié)腸腺癌、71%的前列腺腺癌、80%的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，和100%的喉癌標(biāo)本［8-10］，因此可作為腫瘤診斷的新指標(biāo)。survivin基因在肺癌診斷中的意義國內(nèi)外均有報道，但其在NSCLC惡性胸腔積液中檢測結(jié)果及其臨床意義的報道較少。

本研究顯示，NSCLC患者惡性胸腔積液中survivin表達(dá)的陽性率為77.08%，而在非惡性胸腔積液中無表達(dá)，提示survivin在NSCLC惡性胸腔積液中表達(dá)上調(diào)。由于survivin蛋白是凋亡抑制蛋白，具有抑制細(xì)胞凋亡的功能，在腫瘤細(xì)胞或核異型等細(xì)胞中明顯表達(dá)，而正常的細(xì)胞中幾乎無或很少表達(dá)，故惡性胸腔積液中survivin蛋白的檢出陽性率明顯高于良性胸腔積液。因此檢測 survivin可能具有早期診斷價值，并可能成為一個新的惡性胸腔積液診斷標(biāo)志。

有研究表明，survivin的表達(dá)與NSCLC的預(yù)后相關(guān)［11］，而 Huang 等［12］根據(jù)系統(tǒng)性文獻(xiàn)回顧亦得出，survivin的高表達(dá)提示NSCLC患者的預(yù)后較差。本研究結(jié)果證實，NSCLC惡性胸腔積液中未表達(dá)survivin者生存時間明顯長于陽性表達(dá)者，表明檢測survivin對預(yù)測肺癌預(yù)后有一定的價值，也可以作為預(yù)后不良的指標(biāo)之一。

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