孟麗娟 王峻 樊衛(wèi)飛 蒲驍麟 王琳 劉福銀 楊民

EML4-ALK融合基因是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中最新發(fā)現(xiàn)的一種癌基因，該融合基因的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)研究是2009年NSCLC的10大事件之一。EML4-ALK融合基因可導(dǎo)致腫瘤基因ALK結(jié)構(gòu)激活，現(xiàn)已是新的NSCLC診斷標(biāo)志和治療靶標(biāo)。本文比較了不吸煙或少吸煙的EGFR野生型和EGFR狀態(tài)未明2組肺腺癌患者中EML4-ALK融合基因檢測(cè)的陽(yáng)性率，以探討結(jié)合臨床特征和分子事件篩選檢測(cè)人群的可行性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 試劑 DNA提取試劑盒(天根生物有限公司)，TaqDNA聚合酶、PCR引物、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(上海生物工程有限公司);ALK基因斷裂重組試劑盒(北京金菩嘉有限公司)。

1.2 研究對(duì)象 選擇2010年1月至2012年10月在我院住院及門(mén)診就診的新診斷的肺腺癌患者。入組對(duì)象需同時(shí)符合以下2點(diǎn):(1)經(jīng)病理確診為NSCLC;(2)不吸煙或少吸煙者。共100例，男56例，女44例，年齡34～72歲，平均(57.1±3.1)歲。根據(jù)EGFR狀態(tài)分為EGFR野生型組和EGFR狀態(tài)未知組。EGFR野生型組50例，其中男29例(58%)，女21例(42%);年齡34～72歲，平均(57.3±3.4)歲，＜60歲者28例(56%)，≥60歲者22例(44%);臨床分期Ⅰ期5例(10%)，Ⅱ期18例(36%)，Ⅲ期27例(54%)。EGFR狀態(tài)未知組50例，其中男27例(54%)，女23例(46%);年齡35～70歲，平均(56.5±2.7)歲，＜60歲者29例(58%)，≥60歲者21例(42%);臨床分期Ⅰ期 4例(8%)，Ⅱ期 17例(34%)，Ⅲ期 29例(58%)。2組在性別、年齡及疾病分期方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 直接測(cè)序檢測(cè)EGFR突變

1.3.1.1 石蠟標(biāo)本DNA提取:(1)石蠟標(biāo)本按10～15 μm切片。切片刮取包埋組織若干，置1.5 ml EP管，加二甲苯1200 μl震蕩混勻，55～60℃溫育2～3 h進(jìn)行脫蠟處理;(2)8000 r/min離心10 min，去除二甲苯;(3)加 無(wú) 水 乙 醇 1200μl，震 蕩 混 勻，10 000 r/min離心5 min后吸棄乙醇。(4)37℃烤箱干燥30 min，55℃過(guò)夜消化后按基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.1.2 引物設(shè)計(jì)及合成:EGFR 18～21號(hào)外顯子引物序列見(jiàn)下表，所有引物序列均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，詳見(jiàn)表1。

表1 EGFR外顯子引物序列

1.3.1.3 巢氏PCR擴(kuò)增:石蠟標(biāo)本提取全基因組DNA應(yīng)用巢氏PCR進(jìn)行2輪擴(kuò)增。巢氏PCR第1輪擴(kuò)增體系:PCR反應(yīng)體系總體積為25 μl，包括:基因組DNA 2 μl，Mix 12.5 μl，Primer 1F 1 μl，Primer 1R 1 μl，ddH2O 8.5 μl。巢氏PCR第2輪擴(kuò)增體系:第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物 2 μl，Mix 12.5 μl，Primer 2F 1 μl，Primer 2R 1 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件:EGFR 基因第1輪擴(kuò)增反應(yīng)條件:初始變性(95℃，5 min);30個(gè)循環(huán):變性(94℃，30 s)，退火(60 ℃，30 s)，延伸(72℃，1 min);最終延伸(72℃，10 min)。EGFR基因第2輪擴(kuò)增反應(yīng)條件:初始變性(95℃，5 min);35個(gè)循環(huán):變性(94℃，30 s)，退火(60℃，30 s)，延伸(72℃，1 min);最終延伸(72℃，10 min)。

1.3.1.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA測(cè)序及突變解讀:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳證實(shí)后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成DNA測(cè)序。運(yùn)用CIIROMAS軟件解讀基因測(cè)序圖形。運(yùn)用The Basic Local AI ignment Search Tool(BLAST)將DNA序列與標(biāo)準(zhǔn)野生型DNA序列進(jìn)行比較，找出變異位點(diǎn)，若在所檢測(cè)的核苷酸的相對(duì)應(yīng)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)有變異，則可能為基因突變。突變的最終確定需要肉眼對(duì)DNA圖形進(jìn)行確認(rèn)。

1.3.2 FISH法檢測(cè)EML4-ALK融合基因

1.3.2.1 操作步驟:石蠟標(biāo)本按4 μm切片。按下述步驟操作:(1)56℃，烤片3～5 min;(2)室溫，松節(jié)油10 min 2次;(3)室溫，100%乙醇5 min;(4)室溫，100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇各2 min;(5)室溫，去離子水3 min，用無(wú)線(xiàn)紙巾吸取多余的水分;(6)50℃，酸性亞硫酸鈉30 min;(7)37℃，蛋白酶K 10～30 min［取0.4 ml蛋白酶K儲(chǔ)存液(20 mg/ml)溶于40 ml 2×SSC(pH 7.0)得到蛋白酶 K工作液(200 μg/ml)］;(8)室溫，2×SSC 5 min 2次;(9)室溫，70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇各3 min;(10)自然干燥玻片;(11)56℃，烤片2～5 min;(12)探針準(zhǔn)備:雜交液8 μl和探針 2 μl加入到 0.5 ml離心管中混勻，離心1～3 s，備用。(13)將10 μl探針混合物滴加于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠封邊;(14)準(zhǔn)備雜交儀器，共變性條件，83℃ 7 min，雜交條件，42℃ 16 h;(15)46℃，2×SSC 5 min;(16)46℃，0.1%NP-40/2×SSC 5 min;(17)室溫，70%乙醇3 min后于暗處自然風(fēng)干玻片;(18)室溫，將15μl DAPI復(fù)染劑滴加于玻片雜交區(qū)域，立即蓋上蓋玻片，15 min后觀察。

1.3.2.2 FISH結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):綠色探針示ALK基因5'端，紅色探針示ALK基因3'端。兩者融合為黃色，表示ALK基因未發(fā)生重排，即無(wú)EML4-ALK融合基因;兩者分離表示ALK基因發(fā)生重排，即存在EML4-ALK融合基因。計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，其中異常細(xì)胞≥20%為陽(yáng)性，＜20%則為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。率的比較采用卡方檢驗(yàn)，雙側(cè)檢驗(yàn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EML4-ALK融合基因發(fā)生率 EGFR野生型組有15例EML4-ALK融合基因陽(yáng)性(15/50，30%);EGFR狀態(tài)未知組有4例EML4-ALK融合基因陽(yáng)性(4/50，8%)，2組比較有顯著性差異(P＜0.05)。FISH陰性結(jié)果見(jiàn)圖1，陽(yáng)性結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.2 EML4-ALK融合基因陽(yáng)性患者臨床特征 100例患者中，EML4-ALK融合基因發(fā)生率與年齡、性別、腫瘤分期無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

3 討論

全球肺癌每年平均新發(fā)病例數(shù)超過(guò)160萬(wàn)，其中85%為NSCLC，＞50%的NSCLC患者在初診時(shí)已是晚期［1］。在肺癌發(fā)病率迅速增長(zhǎng)的同時(shí)，肺癌的構(gòu)成比例也發(fā)生著重要變化，鱗癌比例下降，腺癌比例上升，已成為NSCLC中最常見(jiàn)的病理類(lèi)型。2011年，國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)(IASLC)、美國(guó)胸科學(xué)會(huì)(ATS)及歐洲呼吸學(xué)會(huì)(ERS)聯(lián)合頒布了肺腺癌的國(guó)際多學(xué)科分類(lèi)新標(biāo)準(zhǔn)。新標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)一步細(xì)化診斷，重視重要分子事件如EGFR突變、K-RAS突變、EML4-ALK融合基因等。次年，《2012非小細(xì)胞肺癌NCCN指南》作出了重要修訂，明確了FISH為EML4-ALK融合基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。不同的分子事件需要不同的治療方法，比如:EGFR突變、K-RAS野生型的患者首選表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)［2］;EML4-ALK融合基因陽(yáng)性的患者則不能從EGFR-TKI治療中獲益，目前針對(duì)EML4-ALK融合基因的靶向藥物正在臨床研究中。

2007年日本學(xué)者Soda等［3］首次在NSCLC患者術(shù)后標(biāo)本中檢測(cè)到EML4-ALK融合基因。此后，美國(guó)、日本、韓國(guó)及中國(guó)香港均有報(bào)道［4-6］。檢測(cè)EML4-ALK融合基因有切實(shí)的臨床意義。最近一項(xiàng)開(kāi)放、多中心參與的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，82例EML4-ALK融合基因陽(yáng)性NSCLC患者口服crizotinib(ALK及c-Met基因的共同抑制劑)后，總體有效率為57%(47/82)，8周疾病控制率為87%［7］?？梢?jiàn)，針對(duì) ALK的靶向治療成為治療EML4-ALK融合基因陽(yáng)性患者的一種重要方法。

然而，EML4-ALK融合基因在NSCLC患者中陽(yáng)性檢出率較低，僅約1.5% ～6.7%。Shaw等［8］為了提高該融合基因的檢出率，設(shè)定入組患者必須具備2種或更多的下列臨床特征:女性、亞裔、無(wú)或僅少量吸煙史、腺癌。結(jié)果顯示該融合基因的陽(yáng)性率可提高到13%(19/141)，如果不吸煙或僅少量吸煙者和(或)不伴有EGFR突變者，其陽(yáng)性率分別高達(dá)22%和33%。Sasaki等［6］統(tǒng)計(jì)了8個(gè)包括亞洲人、歐洲人的大樣本臨床研究，共1276例，不吸煙或輕度吸煙的NSCLC患者中EMIA-ALK表達(dá)陽(yáng)性率為9.4%，而在吸煙的NSCLC患者中，陽(yáng)性率只有2.9%。EGFR和KRAS基因均為野生型的高加索肺腺癌患者中ALK融合基因陽(yáng)性率(FISH法)高達(dá)30%以上，而EGFR和KRAS基因均為野生型的中國(guó)肺腺癌患者中ALK融合基因陽(yáng)性率(RACE——coupled PCR 法)卻達(dá)到了 42.8%［6］。這提示我們，經(jīng)篩選的病例可顯著提高EML4-ALK融合基因的陽(yáng)性率。本研究顯示經(jīng)病理確診的不吸煙或少吸煙的肺腺癌患者，EGFR野生型組EML4-ALK融合基因陽(yáng)性率達(dá)30%，而EGFR狀態(tài)未明組EML4-ALK融合基因陽(yáng)性?xún)H8%，2組差異有顯著性。EML4-ALK融合基因發(fā)生率與年齡、性別、臨床分期無(wú)明顯相關(guān)性。陽(yáng)性率小于國(guó)內(nèi)報(bào)道值(40%)，可能與篩選方案不同及檢測(cè)方法不同有關(guān)。Zhang等［9］的研究同時(shí)檢測(cè)了EGFR和K-RAS狀態(tài)，要求兩者均為野生型，EML4-ALK融合基因采用的是RACE——coupled PCR法;本研究?jī)H要求EGFR為野生型，同時(shí)采用的FISH法檢測(cè)EML4-ALK融合基因。本研究顯示在不吸煙或少吸煙的肺腺癌患者中，經(jīng)EGFR基因狀態(tài)篩選可提高M(jìn)L4-ALK融合基因檢測(cè)陽(yáng)性率。由于本研究樣本量偏小，結(jié)果仍有待大規(guī)模的研究進(jìn)一步佐證。

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