王 莉，趙 樺，徐 皓

1陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中723000;2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070

小叢紅景天［Rhodiola dumulosa(Franeh)S．H．Fu］為景天科紅景天屬植物，又名鳳尾七、風(fēng)尾草、鳳凰草、香景天［1］。它是一種民間常用的藥用植物，是陜西省地道藥材“七藥”之一。藥理學(xué)研究證明紅景天具有抗缺氧、抗疲勞、抗微波輻射、抗毒、抗癌、抗老化、抗不良刺激、活血化淤等功效［2］。

一些研究表明多糖不僅是生物體必不可少的成分，而且還具有多種生理機能，如真菌多糖具有抗病毒、抗凝血、降血脂、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老等多種生物學(xué)活性，已被開發(fā)成多種藥物和功能性食品添加劑。大量研究表明中藥材多糖具有多種生理活性，如增強免疫功能、抗腫瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系統(tǒng)保護(hù)等［3-5］。研究表明，中藥紅景天的紅景天多糖具有特殊的生理活性和藥理作用，對抗輻射、抗疲勞、抗病毒、提高免疫力、抗癌、降血糖、抗缺鐵性貧血、抗肺炎性哮喘、抗氧化、抗菌以及冷凍保存精子保護(hù)等方面均有作用［6］。目前對小叢紅景天化學(xué)成分的系統(tǒng)研究報道較少［7，8］，對小叢紅景天多糖的研究尤其是多糖的含量測定及抗氧化活性方面的報道甚少。本實驗采用秦巴山區(qū)產(chǎn)小叢紅景天為材料，重點分析研究其多糖類化合物的含量及體外抗氧化活性，深入了解小叢紅景天藥材中有效成分的基本情況，為該藥材的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1．1 實驗材料

實驗用藥材小叢紅景天(鳳尾七)為景天科植物小叢紅景天［Rhodiola dumulosa(Franch．)S．H．Fu］的干燥根莖，均購自陜西漢中中藥材市場，并經(jīng)漢中藥檢所彭強主任藥師鑒定。

1．2 儀器與試劑

1．2．1 儀器

AB204-型電子分析天平(梅特勒);HH-4型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉儀器有限公司);UV-2550紫外分光光度計(日本島津);KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);722-光柵分光光度計(上海分析儀器總廠)。

1．2．2 試劑

無水乙醇(國產(chǎn)分析純)、硫酸亞鐵(國產(chǎn)分析純)、30%雙氧水(國產(chǎn)分析純)、磷酸氫二鈉(國產(chǎn)分析純)、磷酸二氫鈉(國產(chǎn)分析純)、鄰菲啰啉(國產(chǎn)分析純)、2，2-二苯基-1-苦基苯肼(DPPH)(Sigmaaldrich公司);叔丁基對苯二酚(TBHQ，色譜純)，Sigma-aldrich公司;抗壞血酸(Vc)、純凈水。2 g/L的蒽酮硫酸溶液(精密稱取蒽酮0．2 g溶于100 mL濃硫酸中，現(xiàn)配現(xiàn)用)。

2 實驗方法

2．1 小叢紅景天中多糖提取及精制

2．1．1 提取流程

50℃烘干藥材→粉碎過24目篩→乙醚索氏提取脫脂→95%乙醇回流提取(去除單糖、低聚糖、苷類及生物堿等干擾成分)→抽濾→所得濾渣按一定料液比進(jìn)行超聲浸提→抽濾→濾液水浴濃縮→加入乙醇，使乙醇含量達(dá)到80%以上靜置過夜→抽濾，回收乙醇→所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌→揮干溶劑后，50℃烘干，得到粗多糖。

2．1．2 精制流程

稱取1．0 g粗多糖，用100 mL純凈水溶解，加入一定量的10%三氯乙酸，振蕩后冷藏靜置12 h，離心15 min(3500 rpm)，合并濾液且減壓濃縮至適量體積，加入無水乙醇使其含醇量達(dá)80%以上，靜置過夜，抽濾，洗滌，干燥，得去蛋白多糖。

2．2 小叢紅景天多糖含量測定

采用蒽酮-硫酸法測定植物多糖含量［9］。

2．2．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取烘至恒重的無水葡萄糖25 mg，置于500 mL容量瓶中，用無離子水溶解并定容至刻度，即配成50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別精密吸取0．4、0．8、1．2、1．6、2．0 mL 儲備液置于試管中，加入1 mL蒸餾水，再分別加入10 mL 2 g/mL的蒽酮–硫酸試劑(冰水浴中)，搖勻，沸水浴15 min，取出后于冰水浴中冷卻至室溫。在620 nm處測吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2．2．2 樣品溶液制備

稱取小叢紅景天藥材粉末10．00 g，以乙醚為溶劑，45℃索氏提取儀去脂至乙醚為無色;藥渣揮干乙醚，置于圓底燒瓶中，用95%的乙醇90℃回流2 h;抽濾，所得濾渣按一定料液比加蒸餾水，超聲波浸提(按一定的超聲功率、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)浸提)，抽濾，濾液水浴濃縮，加入乙醇，使乙醇含量達(dá)到80%以上，直到不再產(chǎn)生新的沉淀為止，靜置過夜;抽濾，回收乙醇，所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌;揮干溶劑后，50℃烘干，得到粗多糖。精密稱取粗多糖粉末10 mg，于100 mL容量瓶中，用無離子水溶解并定容至刻度，備用。

2．2．3 小叢紅景天多糖含量測定方法學(xué)考察

2．2．3．1 穩(wěn)定性

精密吸取1 mL樣品溶液于試管中，參照2．2．1同樣顯色操作處理，測定吸光值A(chǔ)，考察同一樣品在135 min內(nèi)的吸光值穩(wěn)定性(n=3)。吸光值在0～105 min中內(nèi)較為穩(wěn)定，其平均值為0．265，RSD為0．8%，證實樣品在105 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．2．3．2 精密度

精密吸取1 mL供試液于試管中，按照2．2．1測定方法測定其吸光值，連續(xù)測定6次，考察實驗精密度性。吸光值平均值為0．263，RSD為0．3%，顯示實驗精密度良好。

2．2．3．3 重現(xiàn)性

按照供試液制備方法制備小叢紅景天多糖供試品溶液6份，按照2．2．3．1測定方法測定其吸光值測定其吸光值，考察實驗重性。吸光值平均值為0.264，RSD值為1．0%，表明實驗的重現(xiàn)性好。

2．2．3．4 加樣回收率

精密吸取已知多糖含量供試液5份，溶液中加入一定量的對照品。按照2．2．3．1測定方法測定其吸光值，連續(xù)測定5組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示，小叢紅景天多糖的平均回收率為97．76%，RSD為0．56%。

表1 回收率實驗(n=5)Table 1 Results of recovery tests(n=5)

2．2．4 小叢紅景天多糖含量檢測

精密吸取1mL樣品溶液于試管中，參照2．2．1同樣顯色操作處理，測定吸光值A(chǔ)。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線可計算小叢紅景天多糖的濃度C(小叢紅景天多糖濃度以葡萄糖濃度計)和多糖含量。

多糖含量(%)=［(C×N×V)/m2×1000］×m1/M

式中:C為樣品液中多糖的質(zhì)量濃度(μg/mL);N為稀釋因子;V為樣品液的體積(mL);m1為粗多糖質(zhì)量(g);m2為測量時所取的粗多糖質(zhì)量(mg);M為樣品質(zhì)量(g)。

2．3 小叢紅景天多糖的體外抗氧化活性

2．3．1 對羥自由基(·OH)清除率的測定

采用鄰二氮菲－Fe2+氧化法檢測H2O2/Fe2+產(chǎn)生的羥自由基。取0．75 mmol/L的鄰二氮菲溶液1．0 mL，加50 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH7．4)1．5 mL，加 0．75 mmol/L 的 FeSO4溶液 1．0 mL，加0.01%的H2O21．0 mL，每加一管立即混勻，最后以純凈水補充總體積至10．0 mL。多糖溶液及Vc溶液清除·OH的作用，依上法分別加入不同濃度的多糖和Vc溶液2．0 mL后再加入0．01%的H2O2。反應(yīng)液37℃反應(yīng)1 h，于536 nm處測吸光度A。未損傷管為不加H2O2及多糖溶液或Vc溶液，損傷管只加H2O2溶液［10］。按照以下公式計算對羥自由基(·OH)的清除率。

清除率(%)=(A樣品-A損傷)/(A未損傷-A損傷)×100%

2．3．2 對過氧化氫(H2O2)清除率的測定

加入由50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7．4)配制的5 mmol/L的H2O2溶液2．8 mL，再加入不同濃度的多糖和Vc溶液1．0mL，用純凈水補齊至10．0 mL，室溫放置10 min后，于波長230 nm處測定吸光度值A(chǔ)，對照為不加多糖或者Vc溶液［11］。按照以下公式計算過氧化氫(H2O2)的清除率。

清除率(%)=(A樣品-A對照)/A對照×100%

2．3．3 對DPPH·清除率的測定

取2×10-4moL/L的DPPH·無水乙醇溶液2．0 mL，加入2．0 mL不同濃度的待測樣品溶液，室溫(25℃)反應(yīng)40 min，于波長517 nm處測定吸光度Ai，同時測定2．0 mLDPPH·和2．0 mL 無水乙醇在517 nm處的吸光度Ac，以及2．0 mL不同濃度的待測樣品溶液和2．0 mL無水乙醇混合液在517 nm處測定吸光度Aj。按照下式計算不同濃度受試物對DPPH·的清除率(%)［12］。按照以下公式計算對DPPH·的清除率。

清除率(%)=［(Ac+Aj)-Ai］÷Ac×100%

2．4 小叢紅景天多糖的抑菌活性

微量二倍連續(xù)梯度稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)，同時采用平板轉(zhuǎn)種法測定最小殺菌濃度(MBC)。將樣本溶于MH肉湯并進(jìn)行二倍連續(xù)梯度稀釋，稀釋的樣本液依次加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，0．2 mL/孔。于每孔加入106CFU/mL菌液20μL。4℃冰箱作用12 h，置37℃培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果。無細(xì)菌生長的最小樣本濃度為最小抑菌濃度(MIC)。將無細(xì)菌生長孔中培養(yǎng)液取20μL接種于MH平板，37℃培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果，無細(xì)菌生長接種區(qū)域?qū)?yīng)的樣本最小濃度為最小殺菌濃度(MBC)［13］，重復(fù)兩次。

3 結(jié)果與分析

3．1 小叢紅景天多糖含量

按照2．2．1項下方法，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程為:A=0．0032C+0．0008(R2=0．9995)。其濃度在20．00～100．00 μg/mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

按照2．2．4項下方法，測得小叢紅景天樣品中粗多糖的含量為4．08%。

3．2 對羥自由基(·OH)的清除作用

在實驗濃度范圍內(nèi)，小叢紅景天粗多糖、去蛋白多糖和Vc三者對·OH的清除率均隨濃度的增加而增大。Vc清除率增加最快，當(dāng)濃度為0．06 mg/mL時，清除率已達(dá)100%，而在此濃度下，小叢紅景天粗多糖對·OH的清除率為41．28%，去蛋白精制多糖對·OH的清除率為24．68%，由此說明小叢紅景天粗多糖和去蛋白多糖對·OH的清除能力弱于Vc。

當(dāng)濃度為0．1 mg/mL時，小叢紅景天粗多糖對·OH的清除率也能達(dá)到100%;而在此濃度下，小叢紅景天去蛋白多糖的清除率為71．28%。這說明去蛋白多糖對·OH的清除率有所下降。測定結(jié)果如圖1所示。

3．3 對過氧化氫(H2 O2)的清除作用

在實驗濃度范圍內(nèi)，小叢紅景天粗多糖、去蛋白多糖和Vc三者對H2O2的清除率均隨濃度增加而增大，且Vc的清除作用增加較快，當(dāng)濃度為0．02 mg/mL時，Vc的清除率達(dá)到100%，而粗多糖的清除率也能達(dá)到57．39%，但去蛋白多糖的清除率僅為35．13%。當(dāng)濃度為0．35 mg/mL時，粗多糖對H2O2的清除率能達(dá)到100%，而在此濃度下去蛋白多糖對H2O2的清除率僅接近80%。研究結(jié)果說明小叢紅景天粗多糖對H2O2有較強的清除作用，去蛋白多糖的清除作用弱于粗多糖。測定結(jié)果如圖2所示。

3．4 對DPPH·的清除作用

測定結(jié)果如圖3所示:粗多糖和去蛋白多糖的清除率隨實驗濃度的增加而增大，且增加趨勢基本成線性關(guān)系，當(dāng)濃度為0．5 mg/mL時，粗多糖對DPPH·的清除率為76．54%，而去蛋白多糖的清除率為57．69%。說明小叢紅景天粗多糖對DPPH·有較好的清除作用，去蛋白多糖的清除作用弱于粗多糖。相比之下，在Vc和TBHQ的濃度達(dá)到0．1 mg/mL時，二者對DPPH的清除率分別為95．31%和92．62%，此后隨著實驗濃度的變化Vc和TBHQ對DPPH·的清除率的變化不大。

3．5 小叢紅景天多糖的抑菌活性

如表5所示:小叢紅景天多糖對選定的白假絲酵母菌(CMCC85021)、枯草芽胞桿菌(CMCC63501)、金黃色葡萄球菌(ATCC25925)和大腸埃希氏菌(ATCC25922)四種供試菌株均有很好的抑制作用，小叢紅景天多糖對四種供試菌株的抑制作用能力大小順序為白假絲酵母菌＞大腸埃希氏菌＞枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌。

表2 小叢紅景天多糖的抑菌效果Table 2 Antimicrobial activity of R．dumulosa polysaccharide

4 討論

本實驗初步建立了小叢紅景天中多糖的含量測定方法，方法簡便、可靠、穩(wěn)定性好，為小叢紅景天多糖的進(jìn)一步研究開發(fā)提供了一定基礎(chǔ)。

本研究測得小叢紅景天多糖的含量為4．08%。方勇(2011)曾對生長于不同地區(qū)的6種紅景天植物多糖進(jìn)行了分析比較，發(fā)現(xiàn)其多糖的含量有較大的差別。其中高山紅景天多糖含量為4．87%，圣地紅景天3．50%，狹葉紅景天2．98%，玫瑰紅景天2.81%，西藏大花紅景天1．98%，四川大花紅景天1．06%［14］。相比之下，生長于陜西秦嶺的小叢紅景天其多糖含量較高，僅次于高山紅景天的多糖含量。

體外抗氧化實驗結(jié)果表明:小叢紅景天粗多糖和去蛋白多糖對·OH、H2O2和DPPH·有一定的清除作用，清除作用與濃度成正相關(guān)。其中，當(dāng)粗多糖濃度達(dá)到一定值時，粗多糖對H2O2和·OH的清除率均可達(dá)到100%，其清除作用與Vc相當(dāng)。相比之下去蛋白多糖對幾種自由基的清除作用弱于粗多糖的。這可能是在粗多糖去蛋白的過程中，有一部分與蛋白質(zhì)結(jié)合的活性糖被一同去除，使其對自由基的清除作用下降。

抑菌試驗結(jié)果表明:小叢紅景天多糖具有一定的抑菌活性，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和白色假絲酵母均有很好的抑制作用，尤其對白色假絲酵母抑制作用明顯。

研究表明，小叢紅景天植物多糖含量較高，體外實驗證明其具有良好的清除自由基和抑菌、殺菌生物活性。因此，小叢紅景天多糖在醫(yī)藥、保健方面，具有較好的開發(fā)利用價值。

致謝:本文抑菌實驗在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫與病原生物學(xué)系完成，陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院生工082班寇慶同學(xué)參與部分實驗工作，謹(jǐn)此表示感謝!

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