李思碩 簡俊伊 程樹德

以酵母菌雙雜合技術(shù)尋找志賀氏菌IpaH7.8作用蛋白質(zhì)的目標(biāo)蛋白

李思碩 簡俊伊 程樹德

臺灣陽明大學(xué)微生物及免疫學(xué)研究所

背景：志賀氏菌感染能造成人類出血性腹瀉，此菌常帶有一大型毒性質(zhì)體，以攜帶第三型分泌系統(tǒng)及相關(guān)致病基因，并透過此系統(tǒng)釋放作用蛋白，協(xié)助菌體侵入人類腸壁細(xì)胞，操控細(xì)胞功能，以利在細(xì)胞中存活及增殖。IpaH 家族蛋白是作用蛋白中較特別的一群，志賀氏菌常帶有數(shù)個IpaH家族基因，除了在毒性質(zhì)體上，經(jīng)常同時存在染色體上。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上來說，IpaH家族蛋白皆由兩個功能性區(qū)域組成，其C端均為E3泛素連接酶，而N端在不同IpaH 家族蛋白則具有不同的白氨酸重復(fù)序列，可能結(jié)合不同的目標(biāo)蛋白，最后將其泛素化。其中 IpaH4.5、IpaH7.8、IpaH9.8 在侵入宿主細(xì)胞后才釋放；目前已有研究發(fā)現(xiàn)IpaH4.5和IpaH9.8的目標(biāo)蛋白，其他IpaH蛋白的目標(biāo)蛋白和功能則仍未知，因此我們希望利用酵母菌雙雜合技術(shù)找出IpaH7.8的目標(biāo)蛋白。方法：使用酵母菌雙雜合系統(tǒng)篩選，接著將可能的候選蛋白，以其在細(xì)胞內(nèi)的分布、偽陽性的可能性、與IpaH7.8交互作用的強(qiáng)度等，作進(jìn)一步評估，最后以共同沉淀技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：經(jīng)酵母菌雙雜合系統(tǒng)篩選后，我們得到6個候選蛋白，其中多數(shù)參與細(xì)胞的代謝反應(yīng)。其中一候選蛋白-RAD50，主要分布在細(xì)胞核，而我們直接在細(xì)胞中表現(xiàn)IpaH7.8 N端和綠色螢光蛋白的融合蛋白，也發(fā)現(xiàn)綠色螢光聚集在細(xì)胞核，因此推測RAD50為候選蛋白的可能性最高。將IpaH7.8和RAD50進(jìn)行共同沉淀，顯示兩者在生物體外的條件下可互相結(jié)合。

酵母菌雙雜合技術(shù) 志賀氏菌IpaH7.8作用蛋白質(zhì) 目標(biāo)蛋白 共同沉淀法

志賀氏菌為人類的病原菌，當(dāng) 10～100 個菌體感染人類時，即可能造成嚴(yán)重的出血性腹瀉以及發(fā)炎反應(yīng)[1]。其致病性來自毒性質(zhì)體上所攜帶的第三型分泌系統(tǒng) (Type III secre- tion system) 及相關(guān)致病基因[2]。包含這群基因的片段被稱為進(jìn)入?yún)^(qū)域 (Entry region)，當(dāng)此區(qū)域內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活化因子 VirB (第二號毒性基因，Virulence B)受VirF (第六號毒性基因，Virulence F) 活化后，會啟動進(jìn)入?yún)^(qū)域的其他基因，以構(gòu)成第三型分泌系統(tǒng)，同時也活化進(jìn)入?yún)^(qū)域外的osp(外膜蛋白質(zhì)，Outer membrane protein) 家族基因。部分osp家族蛋白已證實(shí)可被釋放至宿主細(xì)胞，降低細(xì)胞的免疫反應(yīng)，協(xié)助志賀氏菌的感染[3-4]。osp家族和ipaA、ipaB、ipaC、ipaD 基因?qū)儆诟腥境跗?(菌體尚未進(jìn)入細(xì)胞前) 最先被分泌的作用蛋白，當(dāng)菌體進(jìn)入宿主細(xì)胞后，IpgD會與MxiE結(jié)合，活化另一群作用蛋白的基因，包含部分osp家族，以及ipaH家族，這些作用蛋白被認(rèn)為可抑制細(xì)胞的非專一性免疫反應(yīng)，并減少受感染細(xì)胞的凋亡，幫助細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)存活[5]。

IpaH家族基因在1987年被發(fā)現(xiàn)，在眾多作用蛋白當(dāng)中，IpaH是唯一具有多套(multi-copy)基因的蛋白[6]，且此家族同時存在毒性質(zhì)體，以及細(xì)菌染色體上。在已定序的志賀氏菌株中，有5個ipaH家族基因經(jīng)常出現(xiàn)，總基因數(shù)目則因菌株不同而稍有差異[7]，因此Sasakawa等人認(rèn)為此作用蛋白可能具有重要的功能[8]。

IpaH 蛋白約為 60 kD，從結(jié)構(gòu)上可分為 N 端和 C 端兩部分：N 端具有白胺酸重復(fù)序列 (Leucine rich repeat，LRR)，這樣的重復(fù)序列常被用來與其目標(biāo)蛋白結(jié)合，不同 IpaH 的 N 端則帶有不同的重復(fù)序列；IpaH 家族的 C 端序列則幾乎是相同的，且被發(fā)現(xiàn)具有E3泛素連接酶 (E3 ubiquitin ligase) 的功能[9]。綜合上述推測，IpaH 家族的不同成員，可能具有將其目標(biāo)蛋白泛素化的功能[10]。

Sasakawa等人在2005年發(fā)現(xiàn)，IpaH9.8會進(jìn)入細(xì)胞核，借由和U2AF35結(jié)合，影響mRNA的剪接作用 (splicing)，使mRNA無法成熟(maturation)，進(jìn)而影響介白素8 (interleukin-8)、趨化素 (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted，RANTES)、顆粒單核球群落刺激生長因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF) 和介白素 1β (interleukin-1β)，以抑制宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)[11]；相同團(tuán)隊在2010年又發(fā)現(xiàn)IpaH9.8可和細(xì)胞質(zhì)中的NEMO和ABIN兩個蛋白質(zhì)結(jié)合，NEMO為NF-κB復(fù)合物的前驅(qū)物IKKα-IKKβ 的結(jié)合蛋白，IpaH9.8 可將 NEMO 泛素化，促使其降解，進(jìn)而抑制IL-6的分泌，降低免疫反應(yīng)[12]。

此外，F(xiàn)ernandez-Prada等在 2000 年將志賀氏菌接種至天竺鼠眼球(Sereny test)，觀察正?；蛐?，或分別具有 ipaH4.5或ipaH7.8 基因缺失時，對天竺鼠眼球發(fā)炎的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ipaH4.5或ipaH7.8基因缺失皆增強(qiáng)發(fā)炎反應(yīng)，且 ipaH4.5和ipaH7.8同時剔除將更加劇烈；此論文并未探討其作用機(jī)制，但由此推測，IpaH7.8可能也和抑制發(fā)炎反應(yīng)有關(guān)。其他研究中則指出，IpaH7.8會促使吞噬細(xì)胞的凋亡，調(diào)控機(jī)制仍不清楚[13]。

最近，北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所王芳博士的論文《志賀氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子蛋白 IpaH4.5功能研究》，也以酵母菌雙雜合技術(shù)為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)其目標(biāo)蛋白為p65，借此降低宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)[14]。

本研究以酵母菌雙雜合技術(shù)找尋IpaH7.8可能的結(jié)合蛋白，期望能找到參與免疫反應(yīng)路徑的候選蛋白。

1 材料與方法

1.1 菌株和細(xì)胞株

E. coli 由益生生技公司購買，DH5α菌株作為勝任細(xì)胞和質(zhì)體增殖用，BL21菌株用以生產(chǎn)重組蛋白。酵母菌由陽明大學(xué)鄭明媛教授饋贈，菌株 Y187 (MATα，ura3-52，his3-200，ade 2-101，trp 1-901，leu 2-3，112，gal4D，met，gal80D，URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-Lac，MEL1)，菌株 PJ69-2A，(MATa， trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4D，gal80D，LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3，GAL2UAS- GAL2TATA-ADE2，MEL1)。人類均質(zhì)化互補(bǔ)型去氧核糖核酸基因庫 (normalized cDNA library) 由 Clontech 公司購買。HeLa 細(xì)胞株由陽明大學(xué)林奇宏教授饋贈。

1.2 使用基因序列以及質(zhì)體

IpaH7.8 基因由 Shigella flexneri 2457T 經(jīng)聚合鏈酶連鎖反應(yīng)(PCR)取得。于大腸桿菌表現(xiàn)重組蛋白之質(zhì)體 pTAC- MAT-Tag2由Sigma公司購買。酵母菌表現(xiàn)用質(zhì)體 pACT-2、pAS2-1、pGBP-9由陽明大學(xué)鄭明媛教授饋贈。細(xì)胞表現(xiàn)用質(zhì)體 pEGFP-N2 由陽明大學(xué)林奇宏教授饋贈。

1.3 菌種培養(yǎng)

大腸桿菌菌株皆以 Luria broth (LB) 培養(yǎng)基于 37℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，制成洋菜平板 (agar plate) 時則外加 1.2洋菜膠 (agar) 并視需要添加抗生素：ampicillin (50μg/mL) 或 kanamycin (30μg/mL)。如需 IPTG 誘導(dǎo)，細(xì)菌先培養(yǎng)于外加 0.5glucose 及 0.5yeast extract 之 M9 培養(yǎng)基，隔夜后再 1：1 稀釋至含 1mM IPTG 之 LB 培養(yǎng)基，于 37℃ 培養(yǎng) 2 小時。

1.4 共軛焦顯微鏡觀察

使用 T-Pro Biotechnology 公司之T-Pro Non-liposome Transfection Reagent 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，經(jīng) 12～18 小時后，抽去細(xì)胞之培養(yǎng)液并以 3.7的福馬林溶液 (formaldehyde) 固定，室溫靜置15分鐘，吸去福馬林，再以 PBS 緩沖液沖洗兩次，最后利用 Leica SP5 共軛焦顯微鏡觀察。

1.5 重組蛋白純化

將IpaH4.5或IpaH7.8 接入 pTAC-MAT-Tag2 使其帶有MAT-tag，并轉(zhuǎn)型至 BL21 菌株，經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)表現(xiàn)后，離心去除培養(yǎng)液，再使用裂解溶液 (lysis buffer：triton X100 1% PMSF 50mM 之 PBS 溶液) 懸浮，利用法式細(xì)胞破碎儀 (French press) 打破菌體，接著離心取上清液，通過 His-Trap FF 管柱純化。

1.6 HeLa 細(xì)胞溶解物 (cell lysates)

將10公分培養(yǎng)盤之培養(yǎng)液抽去，以PBS溶液沖洗后，加入 200μL RIPA裂解液，刮下細(xì)胞，經(jīng) 4℃、14000 rpm 離心10分鐘，取上清液使用。

1.7 共同沉淀法

使用 TAN Beads公司之His Mag磁珠，經(jīng) RIPA裂解溶液清洗兩次，并懸浮在 RIPA 裂解溶液，再和重組蛋白混合，于 4℃緩慢搖動30分鐘后，離心去除上清液；接著將帶有重組蛋白之磁珠加入細(xì)胞裂解物中，經(jīng)4℃緩慢搖動1小時后，離心去除上清液，并以樣本緩沖液 (sample buffer) 將磁珠懸浮，以100℃沸水加熱5分鐘后置冰上冷卻。最后離心去除磁珠，取上清液進(jìn)行西方墨點(diǎn)法分析。

1.8 酵母菌雙雜合系統(tǒng)

使用 Y187和PJ69-2A 兩菌株，其中 Y187 為α型，而 PJ69-2A是a型；兩菌株皆無法生長在缺少白胺酸 (leucine)、色胺酸(tryptophan)、腺嘌呤 (adenine)、組胺酸 (histidine) 的培養(yǎng)基上。本研究中所使用的 pGADT7 質(zhì)體帶有 leu2 基因，可使酵母株生長在缺少白胺酸的培養(yǎng)基上；pAS2-1 和 pGBT9 質(zhì)體則帶有 trp2 基因，可使酵母菌生長在缺少色胺酸的培養(yǎng)基上。將獵物蛋白和餌蛋白分別接入其中一個質(zhì)體，并分別轉(zhuǎn)型至 Y187 或 PJ69-2A，經(jīng)交配后，以同時缺少白胺酸和色胺酸的培養(yǎng)基篩選，即得同時帶有兩個質(zhì)體的二倍體。若獵物蛋白和餌蛋白可進(jìn)行交互作用，則菌株可開啟質(zhì)體上的下游基因，進(jìn)一步生長在缺乏腺嘌呤和組胺酸的培養(yǎng)基，若交互作用較強(qiáng)，還可使菌落在含X-α-gal 的培養(yǎng)基上呈藍(lán)色。

1.9 酵母菌培養(yǎng)

一般培養(yǎng)使用 YPAD 培養(yǎng)液；SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp-Leu (2SD)、SD/-Trp-Leu-His-Ade (4SD) 培養(yǎng)液分別用于篩選轉(zhuǎn)型后，或交配后可生長于缺乏特定營養(yǎng)源的菌株。X-α-gal (4mg/mL) 則視需要添加。

1.10 酵母菌轉(zhuǎn)型

酵母菌經(jīng) 30℃隔夜培養(yǎng)后，重新接種，于30℃培養(yǎng)至 OD600達(dá)0.4～0.6，離心去除上清液，以無菌3次水清洗，再離心去除上清液后，以 TE/LiAc 緩沖液清洗，再離心后懸浮于 TE/LiAc 緩沖液，即為酵母菌勝任細(xì)胞；使用1.5mL勝任細(xì)胞，加入150～200μg carrier DNA 和10～50μg質(zhì)體，以及6mL含40PEG3350的TE/LiAc 緩沖液，在30℃培養(yǎng)箱緩慢搖動30分鐘，再加入700μL DMSO，并于42℃水浴15分鐘，最后離心去除上清液，以無菌三次水懸浮，并涂抹在缺乏特定營養(yǎng)源的培養(yǎng)基上。

1.11 酵母菌交配

將具有餌蛋白質(zhì)體的酵母菌株接種至100mL的 SD/-Trp 培養(yǎng)液中，30℃隔夜培養(yǎng)，接著離心并重新懸浮為5mL體積，再和OD600約100的帶有獵物蛋白質(zhì)體之酵母菌1mL混合，并加入45mL YPAD培養(yǎng)液，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24小時。取少量經(jīng)連續(xù)稀釋后涂抹在培養(yǎng)機(jī)上，以計算交配效率，其余則涂抹于缺乏特定營養(yǎng)源的培養(yǎng)基。

1.12 酵母菌菌落聚合酶鏈鎖反應(yīng)

將酵母菌菌落挑入 30μL 0.2SDS溶液中，震蕩15秒后，馬上以95℃隔水加熱4分鐘，于室溫冷卻后，離心取上清液稀釋10倍為DNA樣本。PCR包含一組TUB1引子作為陽性控制組，一組 GAL4 引子確認(rèn)餌蛋白質(zhì)體，及一組 cDNA 用引子獲得基因庫嵌入片段。

2 結(jié)果

2.1 酵母菌轉(zhuǎn)型及交配效率

酵母菌交配完成后，經(jīng)連續(xù)稀釋，將菌液分別涂在 YPDA、SD/-Leu、SD/-Trp、2SD 上，以計算交配效率，回推所得的二倍體數(shù)目約16000個。進(jìn)一步篩選有交互作用者，得到264個陽性菌落，再經(jīng)由酵母菌菌落聚合鏈酶連鎖反應(yīng)確認(rèn)，得到68個菌落帶有cDNA資料庫嵌入片段。進(jìn)一步分析嵌入片段長度，并利用限制酶處理，區(qū)分不同嵌入片段，最后選出28個不同的cDNA嵌入片段。

2.2 候選蛋白篩選

經(jīng)定序后發(fā)現(xiàn)，并非所有嵌入片段都和活化區(qū)域?qū)儆谕婚_放閱讀框架 (open reading frame)，因此最后得到 6 個可轉(zhuǎn)譯出長片段的候選蛋白 (見表1)。

表1 利用酵母菌雙雜合系統(tǒng)所得 6個可轉(zhuǎn)譯出長段的候選蛋白（其中部分候選蛋白僅包含全長 cDNA 之一部分）

為進(jìn)一步分析交互作用強(qiáng)度，我們分別制作帶有 pAS2- 1-IpaH7.8N(高量表現(xiàn)IpaH7.8 N端的質(zhì)體)、pGBT9- IpaH7.8N (低量表現(xiàn)IpaH7.8 N 端的質(zhì)體)、pGBT9-IpaH7.8 (低量表現(xiàn) IpaH7.8全長的質(zhì)體) 的酵母菌株，與帶有候選蛋白質(zhì)體的酵母菌株進(jìn)行交配。

若交配后僅表現(xiàn)his3基因，會因生成腺嘌呤的前導(dǎo)物累積，而呈現(xiàn)紅色菌落，我們將此狀況的交互作用的強(qiáng)度定為 1 分；若可開啟his3和ade2兩基因，則菌落呈現(xiàn)白色，定為 2 分；若可開啟his3、ade2、mel1三個基因，則可在含 X-α-gal 的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍(lán)色菌落，定為3分。結(jié)果顯示候選蛋白中的 WBP5 和 OLFML3與IpaH7.8 N 端有最強(qiáng)的交互作用 (見圖1)。

紅色菌落 1 分開啟 his3 白色菌落 2 分開啟 his3 + ade2 藍(lán)色菌落 3 分開啟 his3 + ade2 + mel1

2.3 IpaH7.8 與候選蛋白在細(xì)胞中的分布

在真實(shí)的情況下，若兩個蛋白發(fā)生交互作用，則需同時出現(xiàn)在細(xì)胞的相同區(qū)域。因此我們分別在 HeLa 細(xì)胞株直接表現(xiàn)與綠色螢光蛋白融合的全長 IpaH7.8，或只有 IpaH7.8 N 端，并利用共軛焦顯微鏡確認(rèn)。結(jié)果表現(xiàn)全長的融合蛋白時，螢光強(qiáng)度偏低，難以判讀，但表現(xiàn) IpaH7.8 N 端的融合蛋白時，綠色螢光有聚集在細(xì)胞核的現(xiàn)象 (圖2)。接著，我們查詢基因本體 (Gene Ontology) 系統(tǒng)中對候選蛋白在細(xì)胞中分布的描述，發(fā)現(xiàn)其中 RAD50 會出現(xiàn)在細(xì)胞核。

圖2 在 HeLa 細(xì)胞中直接表現(xiàn) IpaH7.8 N 端和綠螢光蛋白的融合蛋白，顯示綠色螢光聚集在細(xì)胞核中。左為相位差影像，右為綠色螢光影像。

2.4 以共同沉淀法驗(yàn)證候選蛋白

我們進(jìn)一步在候選蛋白的N端接上FLAG標(biāo)記，轉(zhuǎn)染入 HeLa細(xì)胞表現(xiàn)，另一方面利用大腸桿菌生產(chǎn)帶有MAT 標(biāo)記的IpaH7.8的重組蛋白，以共同沉淀法驗(yàn)證兩者在生物體外的環(huán)境下是否發(fā)生交互作用。由西方墨點(diǎn)法結(jié)果顯示，含有 IpaH7.8的重組蛋白的確可和RAD50結(jié)合，而改以IpaH4.5 重組蛋白取代，便無法得到RAD50 (見圖3)。

RAD50 Mock IpaH7.8IpaH4.5 IpaH7.8IpaH4.5 Total lysateSupernatantPelletSupernatantPellet Total lysateSupernatantPelletSupernatantPellet Anti Flag-Tag Anti tubulin

3 討論

從交互作用強(qiáng)度、候選蛋白在細(xì)胞中的分布、共同沉淀等結(jié)果來說，在我們的候選蛋白中，RAD50是可能性最高的。過去研究指出，RAD50會與MRE11和NBN 蛋白形成復(fù)合物[15]，辨認(rèn)DNA雙股斷裂處，進(jìn)行 DNA 修復(fù)，同時也會透過 ATM 蛋白調(diào)控細(xì)胞周期，使細(xì)胞停留在DNA 合成期 (S phase) 之前[16]。若RAD50受IpaH7.8的結(jié)合并接上泛素，可能會改變其功能，或吸引其他因子與RAD50結(jié)合[17]，而停止細(xì)胞周期。如志賀氏菌的另一個分泌蛋白 IpaB，可透過與Mad2L2的作用，使宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期停止，避免宿主細(xì)胞內(nèi)的志賀氏菌因細(xì)胞分裂而有機(jī)會被排除在細(xì)胞外[18]。

我們原先希望在候選蛋白中看到參與調(diào)控免疫機(jī)制的蛋白，但最后并未發(fā)現(xiàn)，從酵母菌雙雜合技術(shù)層面來說，可能一開始篩選得的二倍體數(shù)目并未完整涵蓋人類的轉(zhuǎn)錄體 (transcriptome)，因而錯失真正的目標(biāo)蛋白，或者其目標(biāo)蛋白在酵母菌表現(xiàn)后影響酵母菌生長，而難以被培養(yǎng)出，這兩點(diǎn)也是酵母菌雙雜合技術(shù)經(jīng)常遇到的基本問題；此外，也可能 IpaH7.8并不直接調(diào)控免疫反應(yīng)，而是透過其他途徑間接影響。若多重復(fù)此實(shí)驗(yàn)，收集更多候選蛋白加以分析，或有較多機(jī)會發(fā)現(xiàn)IpaH7.8在細(xì)胞中的目標(biāo)蛋白。

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