王麗霞，徐志宏*，陳為民，孫品雷，巫冬江，俞春來，包春泉

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2. 杭州市森林和野生動物保護(hù)管理總站，浙江 杭州 310009；3. 浙江省淳安縣森林病蟲害防治檢疫站，浙江 淳安 311700；4. 浙江省桐廬縣森林病蟲防治站，浙江 桐廬 311500）

蟲害馬尾松揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)變化規(guī)律及其誘導(dǎo)鄰近馬尾松抗性的初步研究

王麗霞1，徐志宏1*，陳為民2，孫品雷2，巫冬江2，俞春來3，包春泉4

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2. 杭州市森林和野生動物保護(hù)管理總站，浙江 杭州 310009；3. 浙江省淳安縣森林病蟲害防治檢疫站，浙江 淳安 311700；4. 浙江省桐廬縣森林病蟲防治站，浙江 桐廬 311500）

采用HS/SPME-GC/MS分析了馬尾松蟲害植株與健康株主干樹皮揮發(fā)性物質(zhì)的成分及其含量，對蟲害和健康馬尾松主干樹皮揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律進(jìn)行對比研究。結(jié)果表明：蟲害馬尾松主干樹皮揮發(fā)物的主要成分是萜烯類化合物，分別是 α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、β-月桂烯、D-檸檬烯、石竹烯等，其次是十一烷和十二烷；與對照相比，蟲害馬尾松植株主干樹皮揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量明顯低于對照，證明馬尾松受到蟲害后，體內(nèi)的防御系統(tǒng)被破壞，馬尾松樹體抗性明顯下降；同時(shí)蟲害附近的健康株主干樹皮揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量明顯高于對照，證明馬尾松受到蟲害后，可以誘導(dǎo)鄰近馬尾松樹體啟動了體內(nèi)的防御系統(tǒng)，從而使其產(chǎn)生抗性。

馬尾松；鄰近植株；揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)；變化規(guī)律

植食性昆蟲誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物可以抵御昆蟲侵害或者吸引它們的天敵，也可以誘導(dǎo)鄰近植物產(chǎn)生防御反應(yīng)[1～2]，已有的研究表明：當(dāng)豆科植物葉片受到螨蟲危害后，受傷害的葉片將釋放揮發(fā)性物質(zhì)促成了植物間的相互感應(yīng)，這種由植物向高層營養(yǎng)級所發(fā)出的介質(zhì)信號被稱為“求救信號”[3]。David C Degenhardt等[4]研究證明食草動物傷害后以及應(yīng)用茉莉酸后的西紅柿可以誘導(dǎo)產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)；Arimura G[5]研究還認(rèn)為已蟲害的豆科植物散發(fā)的揮發(fā)性物質(zhì)觸發(fā)了鄰近植物葉片中編碼與發(fā)病機(jī)理相關(guān)的蛋白質(zhì)和苯基丙氨酸氨裂解酶基因的轉(zhuǎn)錄，這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明未受損傷的豆科植物可能是對揮發(fā)性物質(zhì)信號的應(yīng)答。馬尾松毛蟲（Dendrolimus punctatus）是我國南方造林樹種馬尾松（Pinus massoniana）的優(yōu)勢害蟲，具有周期性暴發(fā)的規(guī)律[6]。胡永建等[7]用TCT-GC/MS分析了馬尾松、濕地松揮發(fā)性有機(jī)化合物的晝夜節(jié)律變化，結(jié)果表明：馬尾松晝夜節(jié)律中檢測到的揮發(fā)物主要是萜烯類化合物，其中單萜種類最多，且α-蒎烯和β-蒎烯含量約占整個(gè)揮發(fā)物的 80%，其次是含氧化合物等。任琴等[8]分別對野外及盆栽蟲害馬尾松針葉揮發(fā)物的時(shí)序變化進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明：受害針葉萜烯類化合物多數(shù)在1 h后升高。胡永建等[9]用GC/MS分析了鄰枝針葉不同時(shí)間序列中茉莉酸甲酯的含量，結(jié)果表明蟲害馬尾松鄰枝針葉1 h茉莉酸甲酯含量就有所升高，2 h顯著高于對照（為對照的近1倍），證明馬尾松受到蟲害后，啟動了體內(nèi)的防御系統(tǒng)，并誘導(dǎo)鄰枝產(chǎn)生抗性。茉莉酸甲酯被認(rèn)為是受傷害植物誘導(dǎo)防御基因表達(dá)所必不可少的信號物質(zhì)[10]。王勇等[11]對9種馬尾松樹針葉揮發(fā)性物質(zhì)對松毛蟲赤眼蜂的嗅覺行為反應(yīng)，確定了α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、α-萜品醇乙酸酯4種對松毛蟲赤眼蜂有影響活性的馬尾松樹針葉揮發(fā)性物質(zhì)，其中尤以α-蒎烯和β-蒎烯2種物質(zhì)作用最顯著。據(jù)Boeve J L等[12～14]的研究表明：植物被昆蟲咬食后，其局部和系統(tǒng)部位都會發(fā)生相應(yīng)反應(yīng)，但受害馬尾松誘導(dǎo)鄰近植株產(chǎn)生抗蟲性的研究未見報(bào)道。本研究采用GC/MS對馬尾松蟲害植株與相鄰健康株的揮發(fā)物進(jìn)行了初步分析，旨在探討蟲害馬尾松對鄰近植株的揮發(fā)性物質(zhì)是否具有誘導(dǎo)效應(yīng)，研究結(jié)果初步表明受害馬尾松體內(nèi)的揮發(fā)物較對照明顯增加，同時(shí)可以誘導(dǎo)鄰近植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，這為進(jìn)一步闡明植物的防御策略提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

在桐廬縣城關(guān)鎮(zhèn)實(shí)驗(yàn)林場和杭州留下鎮(zhèn)小和山林場試驗(yàn)基地各選擇有松墨天牛（Monochamus alternatus）蟲害的馬尾松林樣地，然后在樣地里分別選擇新枯死并有松墨天牛危害的馬尾松與鄰近（3 ～ 4 m）健康馬尾松進(jìn)行采樣，并以樣地?zé)o蟲害馬尾松林中的健康株為對照。

1.2 馬尾松主干樹皮的采集

在樣地中選擇具有代表性的蟲害馬尾松、鄰近健康馬尾松及其無蟲害樣地馬尾松林中的健康植株按照上述采樣點(diǎn)采集樣品（在樹干韌皮部上、中、下部采樣，各部高度分別為5、3、1 m），樣本大小為20 mm×20 mm ×1 mm，樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-18℃冰箱中保存，用于揮發(fā)性物質(zhì)的測定。

1.3 揮發(fā)物的HS/SPME-GC/MS檢測

1.3.1 預(yù)處理 從冰柜中取出樣品，在25℃的水浴中迅速解凍，精密稱取1 g樣品置于15 mL頂空瓶中，加入2.4 g NaCl（30%）溶液以促進(jìn)香氣成分的揮發(fā)，加入磁轉(zhuǎn)子，立刻用PTFE/硅橡膠隔墊密封壓緊。全部樣品于50℃磁力攪拌器中平衡15 min，將老化后的PDMS/DVB/CAR萃取頭插入樣品瓶頂空部分于50℃吸附20 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進(jìn)樣口，于260℃解吸3 min，同時(shí)啟動儀器采集數(shù)據(jù)。

1.3.2 儀器的工作條件 GC/MS型號Agilent5975，HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.33 μm)；程序升溫:起始溫度40℃，保持2.5 min，以10℃/min的速度升溫至200℃，保持6 min，檢測器（FID）溫度為250℃，進(jìn)樣口溫度230℃，載氣為氦氣，流速1.0 mL/min。質(zhì)譜接口溫度為260℃，離子源溫度200℃，電離方式EI，離子能量70 ev，掃描質(zhì)量范圍為33 ～ 450 amu。

1.3.3 揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定 數(shù)據(jù)處理采用BF2002色譜工作站軟件，通過計(jì)算機(jī)檢索與NIST05質(zhì)譜庫提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對照，選擇匹配度大于800的鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 受害較嚴(yán)重區(qū)域蟲害馬尾松與相鄰健康株主干樹皮揮發(fā)物的比較

在馬尾松受害較為嚴(yán)重的區(qū)域桐廬市城關(guān)鎮(zhèn)實(shí)驗(yàn)林場，選擇有蟲害的馬尾松林樣地，然后在樣地中分別選擇有代表性的蟲害馬尾松、鄰近健康馬尾松和無蟲害馬尾松林中的健康株采集樣品，采用HS/SPME-GC/MS分析受害馬尾松與相鄰健康主干樹皮揮發(fā)物的變化情況，結(jié)果見表1。從表1可知，受害馬尾松主干樹皮揮發(fā)物的主要成分是萜烯類化合物，分別是1R-α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、β-月桂烯、D-檸檬烯、石竹烯等，其次是十一烷和十二烷、十氫-4，8，8-三甲基-9-次甲基-1，4-亞甲基奧、2-乙烯基-萘等；從表1還可以看出：相鄰健康株（與蟲害植株相鄰的健康株）其揮發(fā)性物質(zhì)在種類及數(shù)量上明顯少于蟲害植株，也明顯少于對照（無病區(qū)馬尾松），即在蟲害較為嚴(yán)重的區(qū)域，蟲害前馬尾松的揮發(fā)性物質(zhì)處于抑制狀態(tài)，蟲害后則釋放大量的揮發(fā)性物質(zhì)并誘導(dǎo)鄰近植株產(chǎn)生抗蟲性。

表1 桐廬市蟲害馬尾松與相鄰健康株主干樹皮揮發(fā)物的比較Table1 VOCs from the damaged pine tree trunk and neighboring healthy one in Tonglu

2.2 蟲害較輕區(qū)域蟲害馬尾松與相鄰健康株主干樹皮揮發(fā)物的比較

在馬尾松受害較輕的區(qū)域杭州市西湖林場，選擇有蟲害的馬尾松林樣地，然后在樣地中分別選擇有代表性的蟲害馬尾松、鄰近健康馬尾松和無蟲害馬尾松林中的健康株采集樣品，采用HS/SPME-GC/MS分析受害馬尾松與相鄰健康主干樹皮揮發(fā)物的變化情況，結(jié)果見表2。從表2可知，蟲害馬尾松主干樹皮揮發(fā)物的主要成分是萜烯類化合物，分別是1R-α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、β-水芹烯、石竹烯和α-石竹烯等，其次是十一烷和十二烷、樟腦萜、十氫-4，8，8-三甲基-9-次甲基-1，4-亞甲基奧、2-乙烯基-萘等；從表2中還可以看出，蟲害馬尾松、相鄰健康株與對照（無病區(qū)馬尾松）的揮發(fā)性物質(zhì)（除蒎烯外）在種類上差異不明顯，而相鄰健康株主干樹皮中的揮發(fā)性物質(zhì)1R-α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯的含量則明顯高于蟲害馬尾松和對照。因而我們認(rèn)為1R-α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯很可能是主要的信號傳遞物質(zhì)。

表2 西湖林場蟲害馬尾松與相鄰健康株主干樹皮揮發(fā)物的比較Table 2 VOCs from the damaged pine tree trunk and neighboring healthy one in Hangzhou

3 結(jié)論與討論

植物株內(nèi)和株間存在著防御信息的交流，而這種信息傳遞的介質(zhì)則是受傷植物釋放出的揮發(fā)性化合物[15～18]。鄧文紅等[19]研究表明采用茉莉酸甲酯和萜烯混合熏蒸能夠代替蟲害等外界傷害的刺激，使馬尾松啟動相似的信號防御系統(tǒng)，達(dá)到防御外界傷害的作用，因而茉莉酸甲酯和萜烯可作為馬尾松響應(yīng)傷害的報(bào)警信號。本研究中α-蒎烯和β-水芹烯在健康植株中含量的明顯變化（蟲害較輕區(qū)域）也證明了這一點(diǎn)。

鄧文紅等研究蟲食與熏蒸對馬尾松揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，蟲害和熏蒸處理后，水芹烯的相對含量在損傷枝、姊妹枝、系統(tǒng)上枝和系統(tǒng)下枝中均明顯高于對照；β-蒎烯相對含量在損傷枝和姊妹枝中升高，而系統(tǒng)枝條中下降；α-蒎烯相對含量在所測 4個(gè)部位中除熏蒸后系統(tǒng)下枝升高外其余全部降低。本次研究結(jié)果也證明，在蟲害較輕的區(qū)域，蟲害馬尾松、相鄰健康株與對照（無病區(qū)馬尾松）的揮發(fā)性物質(zhì)（除蒎烯外）在種類上差異不明顯，而相鄰健康株主干樹皮中的揮發(fā)性物質(zhì)1R-α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯含量則明顯高于蟲害馬尾松和對照，這與鄧文紅等的研究結(jié)果基本一致。

另外馬尾松在蟲害前后其揮發(fā)性物質(zhì)呈現(xiàn)出先抑后揚(yáng)的變化規(guī)律，即在蟲害較為嚴(yán)重的區(qū)域，相鄰健康株（與蟲害植株相鄰的健康株）的揮發(fā)性物質(zhì)在種類及數(shù)量上明顯少于蟲害植株，也明顯少于對照，蟲害前馬尾松的揮發(fā)性物質(zhì)處于抑制狀態(tài)，蟲害后則釋放大量的揮發(fā)性物質(zhì)并誘導(dǎo)鄰近植株產(chǎn)生抗蟲性；而在蟲害較輕的區(qū)域中，蟲害馬尾松、相鄰健康株與對照（無病區(qū)馬尾松）的揮發(fā)性物質(zhì)（除蒎烯和水芹烯外）在種類和數(shù)量上差異不明顯。因此本研究結(jié)果證明：馬尾松在植物株間存在著防御信息的交流，這種信息傳遞的介質(zhì)可能是蟲害后傷口釋放出的揮發(fā)性化合物。然而蟲害植株向鄰近植株傳遞的最主要的信號物質(zhì)是否為 1R-α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯還有待于今后進(jìn)一步證實(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)的具體調(diào)節(jié)機(jī)制也尚未明了，有待于今后作進(jìn)一步研究。因此，今后將進(jìn)一步從分子機(jī)理上闡明植物防御反應(yīng)的相關(guān)機(jī)制，找出參與植物通訊的有效信號分子。

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Preliminary Study on Changes in Volatile Compounds from Damaged Pinus massioniana Trunk and the Neighboring Healthy One

WANG Li-xia1，XU Zhi-hong1*，CHEN Wei-min2，SUN Pin-lei2，WU Dong-jiang2，YU Chun-lai3，BAO Chun-quan4
（1. School of Agriculture and Food Science, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 2. Hangzhou Forest and Wild Animal Conservation Station of Zhejiang, Hangzhou 310009, China; 3. Chun’an Forest Pest Control and Quarantine Station of Zhejiang, Chun’an 311700, China; 4. Tonglu Forest Pest Control Station of Zhejiang, Tonglu 311500, China）

The composition and content of volatile organic compounds (VOCs) from damaged Pinus massioniana trunk and that from neighboring healthy one and the control was analyzed by HS/SPME/GC/MS. The results showed that major composition of VOCs from damaged tree was terpenes. Types and content of VOCs from damaged trees were evidently lower than that from the control. While types and content of VOCs from neighboring healthy trees were significantly higher than that from the control.

Pinus massoniana; neighboring tree; volatile organic compounds

S763.3

B

1001-3776（2013）06-0051-06

2013-07-01；

2013-10-08

“松材線蟲病疫木除害和松褐天牛綜合控制技術(shù)”杭財(cái)預(yù)〔2008〕144號、杭財(cái)預(yù)〔2009〕111號

王麗霞（1967-），女，浙江平湖人，副教授，博士，從事林產(chǎn)化工加工研究；*通訊作者。