王慧敏，王慶麗，朱軍莉

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州310035）

養(yǎng)殖魚類富含營養(yǎng)，然而魚肉組織脆弱，水分和蛋白含量高、組織酶活躍，極易導致新鮮度下降及腐敗變質(zhì)。自溶酶、脂肪氧化、外源污染等因素均會引起魚肉品質(zhì)劣變，其中微生物生長及代謝形成的胺、硫化物、醛、酮和有機酸等，產(chǎn)生不良氣體和風味，是引起腐敗的主要原因之一[1]。而溫度是影響魚類捕撈后貯藏和流通加工中品質(zhì)變化的重要因素。因此，低溫保鮮仍是目前水產(chǎn)魚類應(yīng)用最廣泛的保鮮技術(shù)，其中冷藏保質(zhì)期短，且在貯藏過程中魚肉的新鮮度下降快。而微凍保鮮技術(shù)是將新鮮魚放入低于魚肉冰點以下的冰凍海水中迅速冷卻，然后將魚體保存在-2～0℃區(qū)域內(nèi)保鮮[2]，該方法可有效保持魚肉的鮮度。

鱸屬鱸形目，脂科，鱸屬，在我國沿海以黃海、渤海較多分布，是重要的經(jīng)濟魚類之一。近年來，隨著鱸產(chǎn)量逐年增加，僅僅活體運輸銷售方式很難滿足鱸魚快速增長的需求。目前鱸的保鮮研究較少，有學者已研究了低溫貯藏過程中鱸的鮮度指標和蛋白生化指標的變化[3-4]，并分析了鹽水超冷卻處理[5]和微凍貯藏[6]對鱸魚的新鮮度和質(zhì)構(gòu)變化。然而，從微生物角度分析鱸魚在低溫貯藏過程中細菌菌群變化還鮮有報道。鑒于此，本文通過培養(yǎng)計數(shù)和PCR-變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析的鱸魚在冷藏和微凍條件下的菌落總數(shù)等的變化趨勢及微生物構(gòu)成，同時測定感官特性、TVB-N值、K值和pH的變化，研究微凍貯藏對鱸品質(zhì)的變化規(guī)律，探索微凍保鮮的作用機制，為養(yǎng)殖魚類的低溫貯藏保鮮新技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱸魚 購于杭州市文二路農(nóng)貿(mào)市場，平均尾重（603.4±31.8）g，平均體長（28.4±0.7）cm，36尾；平板計數(shù)瓊脂（PCA）、Long-Hammer培養(yǎng)基（LH）、含鐵瓊脂（IA）、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基（CFC）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）和乳酸菌培養(yǎng)基（MRS） 購買于青島海博生物有限公司；PBS緩沖液和Biospin基因組抽提試劑盒 購買于杭州昊天生物技術(shù)有限公司。

LRH-250A型生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；LDZM-40KCS型滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；KJELTEC 2300型凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司；BCD-277型西門子冰箱 博西華家用電器有限公司；DELTA 320型pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；HPLC 1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司；DCodeTM型變性剃度凝膠電泳儀、Quantity One system型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 將運回實驗室的鮮活鱸采用冰水混合物致死，保鮮袋包裝后分成兩組，每組18尾，分別置于微凍（-2±0.1）℃和冷藏（4±0.5）℃冰箱貯藏備用。

1.2.2 感官評價 采用缺點評分法[7]對鱸魚的氣味、外觀、眼球、鰓和尾部、腹部、肌肉組織為指標進行感官評定，評定人員由經(jīng)過專門訓練的10名人員組成，具體評分標準見表1。

1.2.3 pH測定 參考GB/T 5009.45-2003中的酸度計法，稱取10g勻漿魚肉，加入新煮沸后冷卻的雙蒸餾水90mL，拍打均勻，過濾靜置后，測定pH。

1.2.4 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）測定 參考FOSS應(yīng)用子報[8]測定魚肉中的TVB-N值。TVB-N值單位為mg/100g。

1.2.5 K值測定 K值采用HPLC測定，參考John的方法[9]。

1.2.6 微生物計數(shù) 細菌總數(shù)（TVC）、產(chǎn)H2S菌、假單胞菌、腸桿菌和乳酸菌計數(shù)均采用GB 4789.2-2010平板傾注計數(shù)測定。PCA和LH[10]培養(yǎng)基測定TVC，IA培養(yǎng)基測定產(chǎn)H2S菌，CFC培養(yǎng)基測定假單胞菌，MRS瓊培養(yǎng)基分析乳酸菌，VRBGA瓊脂培養(yǎng)基分析腸桿菌。

1.2.7 PCR-DGGE分析方法 細菌總DNA的抽提：魚肉組織中細菌收集和總DNA的提取參考文獻[11]，LH和PCA培養(yǎng)基中細菌用PBS緩沖液洗滌2次，采用Biospin基因組總DNA，分別對鱸魚0d、品質(zhì)轉(zhuǎn)變期和貨架終點期的樣品提取其總DNA。采用16S rDNA的V3區(qū)進行PCR擴增[11]。前引物（F）：5’-ACTCCTACG GGAGGCAGCAG-3’，后引物（B）：5’-GTATTACCGC GGCTGCTGG-3’，發(fā)卡前引物（F）：5’-CGCCCGCCG CGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCTC CTACGGGAGGCAGCAG-3’。50μL的反應(yīng)體系如下：前后引物各2μL，Taq酶0.5μL，10×Buffer（含Mg2+）5μL，dNTP 4μL，ddH2O 34.5μL。PCR反應(yīng)程序：94℃5min，94℃ 40s，52℃ 1min，72℃ 40s，72℃ 5min，4℃保存。DGGE分析，采用40%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺（37.5∶1），50×TAE緩沖液，配制35%和55%變性膠溶液進行DGGE電泳。電泳后對DGGE膠清晰明亮條帶的割膠回收DNA，進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0進行重復(fù)測量方差分析，Origin 8.5軟件（美國OriginLab公司）繪圖，p＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官分析

圖1 鱸魚在低溫貯藏期間感官評分的變化Fig.1 Changes in sensory attributes of Lateolabrax japonicus during the refrigerated storage

表1 鱸魚感官評分表Table 1 Sensory evaluation of Lateolabrax japonicus

圖1顯示了鱸魚在不同冷藏溫度下新鮮度的感官評分變化。隨著貯藏時間延長，鱸魚在冷藏條件下感官評分明顯高于微凍貯藏的樣品（p＜0.05）。在整個冷藏過程中，感官評分隨著貯藏時間的延長而迅速增加，其中在貯藏的第3d上升顯著（p＜0.05）。鱸魚可接受貨架期時的感官評分為12，經(jīng)冷藏的樣品在第12d時感官不可接受，而微凍貯藏的樣品第18d時在感官上才達到不可接受程度。因此，微凍貯藏比冷藏能更有效的延緩鱸魚感官品質(zhì)的下降，結(jié)果與高昕等[6]結(jié)果相似。

2.2 pH

圖2 鱸魚在低溫貯藏期間pH的變化Fig.2 Changes in pH of Lateolabrax japonicus during the refrigerated storage

鱸魚的初始pH為6.96，在貯藏初期pH呈現(xiàn)先下降后逐漸升高的趨勢。其原因可能是鱸魚被猝死后，體內(nèi)的糖原被降解，生成乳酸等酸類物質(zhì)，造成肌肉pH下降，pH下降程度與肌肉中糖原的含量有關(guān)。而隨著貯藏時間的延長，冷藏3d后魚肉的pH顯著增加[14]，鮮度下降，隨著微生物的繁殖，蛋白質(zhì)被分解為氨、三甲胺、吲哚、組胺等堿性物質(zhì)，使肌肉pH上升。相對于冷藏，微凍貯藏下魚肉的pH下降得更低，而上升更緩慢。因此，微凍貯藏能有效延長魚肉僵直與解僵之間的時間。一般認為，低溫有助于緩解魚體內(nèi)ATP的下降，從而推遲僵硬期的到來和解僵的產(chǎn)生，魚體處于僵硬期時鮮度保持較高的水平。

2.3 TVB-N

圖3 鱸魚在低溫貯藏期間TVB-N值的變化Fig.3 Changes in TVB-N of Lateolabrax japonicus during the refrigerated storage

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）值是評價水產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標之一[12]。TVB-N主要包括魚體腐敗過程中形成的三甲胺、二甲胺、氨類和其他含氮物質(zhì)。隨著魚體死后逐步腐敗，TVB-N相應(yīng)的增加，在某些魚體中發(fā)現(xiàn)TVB-N的增加與貯藏時間呈現(xiàn)良好的線性。水產(chǎn)品品質(zhì)可被消費者接受的TVB-N上限為30mg/100g[13]。鱸魚在不同冷藏溫度條件下TVB-N值的變化如圖1所示，魚肉貯藏初期在TVB-N的含量為10.27mg/100g，表明鱸魚鮮度良好，其結(jié)果與感官分析結(jié)果相似。魚肉中TVB-N值在貯藏的前3d無顯著變化，之后迅速升高。相對于冷藏，微凍貯藏的魚肉TVB-N增加顯著變慢（p＜0.05），可能是由于低溫抑制了魚肉優(yōu)勢腐敗菌活動，從而導致非蛋白化合物氧化脫氨基速度減慢。

2.4 K值

圖4 鱸魚在低溫貯藏期間K值的變化Fig.4 Changes in K value of Lateolabrax japonicus during the refrigerated storage

K值是反映水產(chǎn)品在低溫貯藏前期的鮮度變化，其以肌肉中ATP及其降解產(chǎn)物的含量為基礎(chǔ)，通過計算得到的一個指標。Saito等[14]認為K值小于20%時，魚肉為一級新鮮度；20%～40%時為二級新鮮度，50%為初期腐敗。鱸魚在冷藏的前3d K值增加緩慢，兩個貯藏溫度樣品均在一級新鮮度。3d后隨著貯藏時間的延長，K值迅速升高（p＜0.05），冷藏15d 的樣品K值達到48.45%，出現(xiàn)了明顯的腐敗，而微凍貯藏的樣品K值為35.56%，到18d超過40%。因此微凍貯藏能顯著的抑制鱸魚魚肉中ATP的降解（p＜0.05）。

2.5 細菌計數(shù)

鱸魚在冷藏和微凍貯藏過程中細菌計數(shù)如表2所示。結(jié)果顯示，鱸魚的初始菌落總數(shù)為2.44lg cfu/g，表明鱸魚品質(zhì)良好，與感官和化學指標結(jié)果相似。隨著貯藏時間的延長，冷藏樣品微生物增長迅速，在9d接近6lg cfu/g，15d超過7lg cfu/g。而微凍貯藏的樣品微生物增長緩慢，在貯藏前6d維持低的細菌數(shù)，在18d細菌總數(shù)接近6log cfu/g，21d超過7lg cfu/g。研究中采用PCA和LH兩種培養(yǎng)基評價細菌總數(shù)，結(jié)果顯示LH培養(yǎng)基計數(shù)明顯多于PCA培養(yǎng)基，與Broekaert等[15]報道一致，LH等含鹽培養(yǎng)基比非含鹽培養(yǎng)基的PCA菌落總數(shù)要高許多，表明海水魚類微生物更適宜在含NaCl的培養(yǎng)基上生長。

鱸魚低溫貯藏過程中產(chǎn)H2S細菌、假單胞菌、腸桿菌和乳酸菌的變化如表2所示。鱸魚中四種細菌的初始值含量在1.08～1.65lg cfu/g，隨著貯藏時間的延長，細菌的增長趨勢與細菌總數(shù)的變化表現(xiàn)相似的增長趨勢。H2S細菌、假單胞菌、腸桿菌和乳酸菌在冷藏15d細菌數(shù)分別為7.59、6.05、5.78和5.90lg cfu/g，而在微凍貯藏21d細菌數(shù)分別為6.38、5.60、5.02和4.77lg cfu/g，兩個貯藏溫度之間細菌的增長存在顯著的差異（p＜0.05），其中冷藏條件下細菌增長快于微凍貯藏。在冷藏過程中4種細菌中產(chǎn)H2S細菌和假單胞菌增長最快，貨架期終點產(chǎn)H2S細菌數(shù)接近細菌總數(shù)，腸桿菌和乳酸菌次之。研究表明，養(yǎng)殖鯛在冷藏的貨架期終點優(yōu)勢腐敗菌鑒定為假單胞菌和西瓦氏菌[16]，腐敗西瓦氏菌和或假單胞菌是養(yǎng)殖大黃魚等冷藏魚的主要腐敗菌[17]?？梢?，鱸魚冷藏過程中H2S菌和假單胞菌是鱸冷藏過程中主要的優(yōu)勢腐敗菌，其中微動貯藏能顯著抑制優(yōu)勢腐敗菌的生長。

2.6 DGGE圖譜及序列分析

研究從不同冷藏時間的魚片和兩種培養(yǎng)基中均得到了細菌總DNA，以細菌總DNA為模板進行擴增，獲得目的條帶。冷藏和微凍貯藏過程中鱸魚魚肉和培養(yǎng)樣品中16S rDNA擴增的DGGE結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，冷藏和微凍樣品微生物變化表現(xiàn)相似的趨勢，隨著貯藏時間的延長，條帶數(shù)目的增加并發(fā)生一定的變化。直接抽提DNA樣品與LH和PCA抽提的樣品中大部分條帶位置相同，培養(yǎng)后的樣品中出現(xiàn)條帶多于直接抽提樣品，主要是由于經(jīng)過培養(yǎng)后提取DNA的總量和質(zhì)量都優(yōu)于從魚肉中抽提的DNA。并且，魚肉基質(zhì)中存在的某些成分可能也會影響PCR效果。與生鮮羅非魚中細菌PCR-DGGE結(jié)果相似[18]，直接抽提DNA獲得的微生物多樣性較低。LH和PCA培養(yǎng)基抽提的DNA獲得的DGGE圖譜相比，LH培養(yǎng)具有更多條帶，表明具有更多種類的細菌在該培養(yǎng)基上生長，與計數(shù)結(jié)果相似。

將圖5中DGGE凝膠上的10個主要條帶切下，經(jīng)割膠回收試劑盒純化后，PCR擴增進行測序。從上述DGGE凝膠上的條帶經(jīng)測序后，獲得9個16S rDNA片段序列，提交Genbank比對分析，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，所獲得的序列分別屬于希瓦氏菌屬（Shewanella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）和奧斯陸莫拉氏菌，其中希瓦氏菌和假單胞菌屬分別占55.5%和33.3%。

圖5 鱸魚在低溫貯藏期間DGGE圖譜Fig.5 Changes in K value of Lateolabrax japonicus during storage

由PCR-DGGE圖譜及細菌計數(shù)結(jié)果可知，鱸魚有氧冷藏和微凍貯藏過程條件下的細菌群落變化和優(yōu)勢腐敗菌。希瓦氏菌屬（Shewanella.spp）和假單胞菌屬（Pseudomonas.spp）細菌在整個冷藏過程中均存在，并成為主要優(yōu)勢菌，特別是腐敗希瓦氏菌。上世紀90年代，Dalgaard[19]提出了特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）的概念，水產(chǎn)品所含的微生物只有部分微生物參與腐敗過程，在冷藏中能生存并繁殖，產(chǎn)生三甲胺、胺和H2S等腐敗臭味和異味代謝產(chǎn)物的微生物就是該水產(chǎn)品特定腐敗菌。研究表明，在有氧冷藏中，魚、貝類和甲殼類的SSO多為假單胞菌或者腐敗西瓦氏菌，其中腐敗西瓦氏菌多為海洋溫帶水域的SSO，假單胞菌多為熱帶淡水魚的SSO。1985年希瓦氏菌被劃分為新的屬-希瓦式菌屬[20]，希瓦氏菌屬于嗜冷性菌、革染氏陰性、具有運動性、非發(fā)酵型，大部分菌株能還原氧化三甲胺（TMAO）為三甲胺，產(chǎn)H2S，是水生動物和富含蛋白食品相關(guān)的典型腐敗菌[18]。產(chǎn)H2S菌在剛捕獲的魚中比例小，在貯藏中逐步成為優(yōu)勢菌，細菌數(shù)可以達到107～109CFU/g。因此，利用還原TMAO和產(chǎn)硫化氫的細菌數(shù)量可預(yù)測冰藏魚中剩余的貨架期[21]。

表2 鱸魚在低溫貯藏過程細菌的變化（lg cfu/g）Table 2 Changes in the microbiology of Lateolabrax japonicus during the refrigerated storage（lg cfu/g）

表3 DGGE割膠條帶的16S rDNA序列鑒定Table 3 Sequence and homology of Lateolabrax japonicus at 4℃

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，與4℃冷藏相比，-2℃微凍貯藏的鱸魚樣品感官評分和pH上升緩慢，TVB-N值、K值及細菌總數(shù)增長較慢，表明微凍貯藏能顯著減緩鱸魚品質(zhì)的劣變，延長了貨架期。微生物計數(shù)和PCRDGGE及測序結(jié)果顯示，低溫貯藏過程中鱸魚中細菌總數(shù)和產(chǎn)H2S細菌數(shù)增長趨勢相似，經(jīng)鑒定優(yōu)勢腐敗菌為腐敗西瓦氏菌和假單胞菌屬。

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