孫靈利 趙平 張建花 郭嬌 王甦民

結核病仍然是威脅人類健康的重要疾病，中國結核病患病率位居世界第二[1]，而耐藥肺結核位居世界第一[2]。結核病的早期發(fā)現(xiàn)對結核病的控制至關重要，而細菌學診斷在結核病確診及傳染源的發(fā)現(xiàn)中起著決定性作用。細菌學診斷包括痰涂片找抗酸桿菌和培養(yǎng)。顯微鏡鏡檢是最普及和經(jīng)濟的方法，但敏感度低，并且不能區(qū)分死菌還是活菌。在我國培養(yǎng)法使用最多的是羅氏(L?wenstein-Jensen，L-J)固體培養(yǎng)法，但其培養(yǎng)周期長，后來出現(xiàn)的快速培養(yǎng)系統(tǒng)如BacT/ALERT 3D系統(tǒng)和美國BD公司的自動BACTEC MGIT 960系統(tǒng)(automated BACTEC MGIT 960 system, A-MGIT)在分枝桿菌培養(yǎng)時間和陽性率方面均高于傳統(tǒng)的L-J固體培養(yǎng)方法，但這兩種培養(yǎng)系統(tǒng)儀器和試劑價格均較昂貴。最近出現(xiàn)的手工MGIT系統(tǒng)(manual mycobacteria growth indicator tube system，M-MGIT)價格低廉，設備小巧輕便，適合基層實驗室使用。本研究主要對M-MGIT系統(tǒng)與L-J法和A-MGIT系統(tǒng)的培養(yǎng)結果進行比較，評價其分離培養(yǎng)分枝桿菌的臨床應用價值。

材料和方法

一、材料

1. 標本來源：2012年1月至2013年2月，北京市朝陽區(qū)疾病預防控制中心結核病門診初診患者，按照《肺結核診斷標準(WS 288-2008)》，根據(jù)患者臨床癥狀、體征及胸部影像學檢查確診或高度疑似為肺結核的患者納入本次研究。共有526例患者納入研究，其中男328例，女198例；平均年齡(35±14)歲，最小年齡15歲，最大年齡97歲。每例患者送檢3份痰標本，分別為夜間痰、晨痰和即時痰，選取1份合格的、痰量在3～10 ml的痰標本納入本研究，共有526份痰標本納入本次研究。

2. 儀器和試劑：A-MGIT培養(yǎng)系統(tǒng)包括：BACTEC MGIT 960 自動培養(yǎng)儀，7 ml液體培養(yǎng)管，MGIT營養(yǎng)添加OADC(oleic acid-albumin-dextrose-catalase)，MGIT雜菌抑制劑PANTA(polymyxin B, amphotericin B, nalidixic acid, trimethoprim, and azlocillin)雜菌抑制劑，均為美國BD公司生產(chǎn)。M-MGIT培養(yǎng)系統(tǒng)包括：熒光判讀儀，4 ml液體培養(yǎng)管，MGIT OADC營養(yǎng)添加劑，MGIT PANTA雜菌抑制劑，均為美國BD公司生產(chǎn)。L-J培養(yǎng)基和抗酸染色液均由珠海貝索生物有限公司生產(chǎn)。

二、方法

1. 涂片染色鏡檢及標本的前處理：每份痰標本先進行涂片，涂片后剩余的標本進行處理后培養(yǎng)。涂片染色鏡檢及標本前處理均按照文獻[3]規(guī)程操作，標本處理采用N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)法。

2. L-J培養(yǎng)基分離培養(yǎng)：每份經(jīng)NALC-NaOH法處理的標本接種2支改良L-J培養(yǎng)基，每支L-J培養(yǎng)基接種0.1 ml，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，接種后3、7 d分別觀察結果1次，然后每周觀察結果1次。發(fā)現(xiàn)菌落生長，經(jīng)抗酸染色證實為抗酸分枝桿菌后報告陽性，若為陰性報告污染。若觀察滿8周仍無菌落生長，可報告陰性。

3. A-MGIT分離培養(yǎng)：將1瓶營養(yǎng)添加劑MGIT OADC和1瓶雜菌抑制劑MGIT PANTA混合，取0.8 ml混合液加到7 ml液體培養(yǎng)管中。每支培養(yǎng)管中接種NALC-NaOH處理后的同份標本(每份標本處理完后分別接種L-J培養(yǎng)基2支，A-MGIT培養(yǎng)管1支，M-MGIT培養(yǎng)管1支)0.5 ml，接種后培養(yǎng)管經(jīng)掃描確認，放入全自動BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)儀中培養(yǎng)，由儀器自動監(jiān)測。儀器提示陽性后取出，對培養(yǎng)物進行涂片，經(jīng)抗酸染色鏡檢后證實為抗酸分枝桿菌后報告陽性，若為陰性報告污染，陰性結果為培養(yǎng)42 d后儀器報告陰性后取出，對培養(yǎng)管底部沉淀物進行抗酸染色鏡檢，判定是否假陰性。

4. M-MGIT分離培養(yǎng)：接種標本前，在4 ml液體培養(yǎng)管中分別加入0.5 ml 營養(yǎng)添加劑和0.1 ml 雜菌抑制劑，然后每管接種經(jīng)NALC-NaOH 法處理的同份標本0.5 ml，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從培養(yǎng)的第2天開始，每天用熒光判讀儀對培養(yǎng)管進行檢測。熒光判讀儀報告陽性者，對培養(yǎng)物進行涂片，抗酸染色鏡檢證實為抗酸分枝桿菌后報告陽性，若為陰性報告，則報告污染。培養(yǎng)管連續(xù)培養(yǎng)、監(jiān)測6周時，若熒光判讀儀報告陰性，則標本報告為陰性，并對培養(yǎng)管底部沉淀物進行涂片及抗酸染色鏡檢，判斷是否為假陰性。

5. 統(tǒng)計學分析：應用SPSS 11.0進行數(shù)據(jù)處理，3種方法率的比較采用χ2檢驗，3種方法檢出分枝桿菌時間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、不同培養(yǎng)方法的檢出率比較

每份樣本同時進行涂片鏡檢及3種方法分離培養(yǎng)，結果見表 l。3種不同培養(yǎng)方法共分離出261株分枝桿菌，檢出率為49.6%(261/526)；其中M-MGIT法分離培養(yǎng)出256株，檢出率為48.7%(256/526)；A-MGIT法分離培養(yǎng)出258株，檢出率為49.0%(258/526)；L-J法分離培養(yǎng)出217株，檢出率為41.3%(217/526)。M-MGIT和A-MGIT培養(yǎng)法檢出率均高于L-J培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為5.84和6.45，P值分別為0.018和0.013)，但M-MGIT和A-MGIT培養(yǎng)法檢出率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.02，P=0.951)。在146份涂片鏡檢抗酸桿菌陽性(涂陽)標本中，M-MGIT、A-MGIT和L-J 培養(yǎng)法陽性檢出率分別為94.5%、93.8%和89.0%，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.74，P=0.154)；在380份涂片鏡檢抗酸抗菌陰性(涂陰)標本中，M-MGIT(31.1%)、A-MGIT(31.8%)培養(yǎng)法檢出率均高于L-J法(22.9%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為6.42和7.65，P值分別為0.014和0.007)；但M-MGIT與A-MGIT培養(yǎng)法的檢出率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.05，P=0.876)。

表1 526份痰標本的不同培養(yǎng)方法與痰涂片抗酸染色鏡檢檢出結果比較

注括號內(nèi)數(shù)值為構成比(%)

二、不同培養(yǎng)方法的陽性報告時間比較

M-MGIT法平均陽性報告時間為13 d[(13±6)d]，A-MGIT法平均報告時間為12 d[(12±6)d]，L-J法平均報告時間為24 d[(24±9)d]。M-MGIT和A-MGIT法陽性報告時間明顯短于L-J法，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為15.84和18.32,P值均=0.000)，但M-MGIT和A-MGIT法之間的差異無統(tǒng)計學意義(t=1.89，P=0.071)。M-MGIT法51.2%(131/256)的培養(yǎng)陽性菌株和A-MGIT法52.7%(136/258)的培養(yǎng)陽性菌株的報陽時間在第2周內(nèi)，而L-J法37.8%(82/217)的菌株報陽時間在第3周，35.5%(77/217)的菌株報陽時間在第4周。

三、不同培養(yǎng)方法的污染率比較

M-MGIT和A-MGIT培養(yǎng)法污染率分別為4.6%(24/526)和4.9%(26/526)，每份標本接種L-J培養(yǎng)基2支，共1052支，污染43支，污染率為4.1%，三者間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.64，P=0.726)。

討 論

BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)(A-MGIT)是一種全自動的、高通量的、非放射性的液體培養(yǎng)方法，MGIT培養(yǎng)管底部包埋有熒光物質(zhì)，熒光物質(zhì)將隨著管內(nèi)氧含量的變化而發(fā)生反應，若分枝桿菌在培養(yǎng)管中生長消耗氧，管內(nèi)熒光物質(zhì)被激活，在特定光源的激發(fā)下釋放熒光，系統(tǒng)每小時監(jiān)測培養(yǎng)管內(nèi)的熒光強度一次，從而判斷管內(nèi)分枝桿菌生長情況[4]。 A-MGIT系統(tǒng)已經(jīng)被證明是一種快速、簡便，且敏感度較高的分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)[5-7]，但儀器價格昂貴，在基層結核病實驗室可能無法推廣應用。M-MGIT系統(tǒng)只需要普通的培養(yǎng)箱、底部包埋有熒光物質(zhì)的4 ml MGIT培養(yǎng)管及熒光判讀儀，設備小巧方便，適合基層實驗室使用。兩種培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)管均以7H9肉湯培養(yǎng)基為基礎，加以專用的營養(yǎng)添加劑和雜菌抑制劑，兩者在各成分的量上有所差別。

一般認為分枝桿菌培養(yǎng)法是診斷結核病的金標準，在我國各基層結核病實驗室現(xiàn)在采用的培養(yǎng)法主要還是L-J法。但分枝桿菌在L-J培養(yǎng)基上生長緩慢，而在液體培養(yǎng)基中能快速生長[8]。本研究結果也顯示，以液體培養(yǎng)基為基礎的M-MGIT和A-MGIT兩種培養(yǎng)系統(tǒng)對分枝桿菌的檢出率(48.7%和49.0%)明顯高于L-J培養(yǎng)法(41.3%)，差異有統(tǒng)計學意義，特別是在涂陰標本M-MGIT(31.1%)和A-MGIT(31.8%)的優(yōu)勢與L-J法(22.9%)相比更加明顯，差異有統(tǒng)計學意義。潘愛珍、翁繩鳳和李靜等[9-11]也報道了M-MGIT培養(yǎng)方法較L-J培養(yǎng)法在分枝桿菌檢出方面的優(yōu)越性，并且與A-MGIT方法檢出率差異無統(tǒng)計學意義。

對于未治療患者，一般認為涂陽培陰率不應超過10%，而本研究中L-J法的涂陽培陰率達到11%，并且明顯高于M-MGIT和A-MGIT法，可能因一些患者在確診結核病之前在其他醫(yī)院經(jīng)過了廣譜抗生素的治療，致使結核分枝桿菌活力降低，再加上L-J培養(yǎng)基營養(yǎng)條件低于MGIT培養(yǎng)基，導致涂陽培陰率升高；也有可能因在標本液化和去污染過程中處理液加入的偏多，或時間沒掌握好，處理時間偏長造成的。提示在今后工作中要注意掌握好處理液的量和處理時間。

在檢出時間方面，由L-J法的平均24 d縮短至M-MGIT和A-MGIT法的13 d和12 d，差異有統(tǒng)計學意義，文獻[9-11]也報道了在分枝桿菌檢出時間方面M-MGIT法較L-J法更具有優(yōu)勢。并且兩種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性的菌株分別有51.2%和52.7%在第2周內(nèi)報告陽性，而L-J法37.8%的菌株在第3周內(nèi)報陽，35.5%在第4周內(nèi)報陽。兩種液體培養(yǎng)方法與L-J法比較均顯示了良好的檢出效能，但M-MGIT與A-MGIT在檢出率和檢出時間上的差異無統(tǒng)計學意義。M-MGIT和A-MGIT法對分枝桿菌檢出率高且時間短，可能與前兩者的培養(yǎng)基成分和結果觀察時間間隔有關。如：液體培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分比L-J培養(yǎng)基豐富，并且其中加入了10%的CO2，由于宿主體內(nèi)的實際環(huán)境為缺氧性，使用5%～10%的CO2可能刺激分枝桿菌原代培養(yǎng)物的初期生長[12]。另外，由于L-J法是1周觀察1次結果，并且通過肉眼觀察，而M-MGIT和A-MGIT培養(yǎng)結果觀察通過紫外線檢測熒光強度判斷陽性，其結果判定更敏感，且M-MGIT法是每天監(jiān)測結果，A-MGIT法是每小時監(jiān)測結果1次，這些因素可能對M-MGIT、A-MGIT與L-J法在檢出時間上的差異產(chǎn)生影響，提示這兩種MGIT液體培養(yǎng)基比傳統(tǒng)L-J法快速、敏感。

本研究中，M-MGIT和A-MGIT培養(yǎng)法污染率分別為4.6%和4.9%，L-J培養(yǎng)法污染率為4.1%，三者差異無統(tǒng)計學意義。污染率控制在我國規(guī)范標準2%～5%[3]之內(nèi)，污染率低于Satti等[5]和 Rodrigues等[6]報道的污染率，但高于Somosk?vi等[13]報告的污染率。各研究之間污染率差異很大，可能由于各實驗室的痰標本質(zhì)量、痰留存時間及運輸條件、實驗室條件各不相同造成。

要確定分離出的分枝桿菌是結核分枝桿菌還是非結核分枝桿菌還需進行菌種鑒定, 培養(yǎng)陽性的分枝桿菌中可能存在抗酸染色陽性的非結核分枝桿菌。本研究不足之處是由于本實驗室條件有限，未能對菌株進行菌種鑒定, 未對M-MGIT檢出非結核分枝桿菌的能力進行分析。

總之，M-MGIT法對分枝桿菌的檢出能力明顯優(yōu)于L-J法，與A-MGIT法相當。但M-MGIT法的熒光判讀儀價格(8萬元人民幣左右)遠低于A-MGIT法的BACTEC MGIT 960系統(tǒng)(130萬人民幣左右)，因此，M-MGIT方法較A-MGIT和L-J方法在檢出分枝桿菌方面更具優(yōu)勢，在基層結核病實驗室具有較好的應用前景。

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