陳亮 孫毅凡 陳濤 李海成 江振友 周琳 鐘球

細胞自噬是從酵母到人類都很保守的古老代謝過程[1]，傳統(tǒng)觀點認為自噬已進化為一種重復利用路徑，即其可使真核細胞在饑餓狀態(tài)下通過降解受損或廢棄的細胞器及蛋白質(zhì)而獲得營養(yǎng)[2-3]。近年研究顯示，自噬可作為天然免疫、獲得性免疫和炎癥反應的調(diào)控子發(fā)揮協(xié)助調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能[4-5]，此外，自噬廣泛參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[6-7]，包括癌癥、神經(jīng)退行性病變,以及心血管和肺部疾病等。

早在20世紀50年代在哺乳動物細胞中就已鑒定到自噬的形態(tài)學，隨后詳盡的形態(tài)學和藥理學研究使得自噬過程的基本步驟逐漸明確。目前已鑒定30余個自噬相關(guān)基因(autophagy associated gene，ATG)[5，8]， Atg8/LC3是一種類似于泛素蛋白的蛋白質(zhì)，可與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合。LC3(light chain 3)是目前公認的自噬分子標志物。哺乳動物中有3種LC3，包括LC3A、LC3B、LC3C，它們在自噬過程中存在相關(guān)的翻譯后修飾。LC3B標記熒光蛋白(如GFP、GFP-LC3)已被用于間接免疫熒光或直接熒光顯微鏡的方法測定LC3或GFP-LC3點聚集的增加量來監(jiān)測自噬通量。Atg5和Atg7、Beclin1均是重要的自噬調(diào)控基因，其編碼的相應蛋白在自噬體的形成、泛素樣蛋白通路等多個過程中可發(fā)揮重要作用。自噬的誘導可伴隨著某些自噬基因mRNA水平的增加，可利用northern印跡或?qū)崟r熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)方法檢測LC3等自噬相關(guān)基因的mRNA的水平變化。

近年來，自噬相關(guān)領(lǐng)域的研究已成為熱點。自噬模型也成為研究者常常涉及到的研究模型，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了PMA誘導人類單核/巨噬細胞(THP-1)細胞分化的條件，建立了較好的自噬模型，旨在為以THP-1細胞為基礎(chǔ)的自噬模型構(gòu)建及相關(guān)功能研究提供實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

一、材料和試劑來源

佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)購于Sigma公司(美國)；孔板和抗生素等購于廣州唯民生物科技有限公司；感受態(tài)細菌DH5α購于Transgene公司(中國)；THP-1細胞購于中山大學細胞庫； pcDNA3.1- YFP-LC3質(zhì)粒(簡寫為“YFP-LC3質(zhì)?！?為廣東省結(jié)核病控制中心參比實驗室保存(由中山大學腫瘤防治中心朱孝峰教授饋贈)；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基(簡寫為“1640培養(yǎng)基”)和First-Strand cDNA synthesis M-MLV Kit購于Invitrogen公司(美國)；E.Z.N.A. EndoFree Plasmid Mini Kit購于Omega公司(美國)；LipofectamineTM2000購于Invitrogen公司(美國)；Opti-MEM?Ⅰ Medium購自Gibco公司(美國)；TRIzol?Reagent購自Invitrogen公司(美國)。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反轉(zhuǎn)錄普通PCR儀(SENSOR)、熒光定量PCR儀(CFX96)購自BIO-RAD公司(美國)；低速離心機和高速離心機、細胞培養(yǎng)箱購自Thermo公司(美國)；倒置相差顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司(日本)；倒置熒光顯微鏡IX-73購自 OLYMPUS公司(日本)；NanoDrop 2000分光光度計購自Thermo Scientific公司(美國)。

二、LC3點聚集示蹤細胞自噬模型的建立

(一)PMA誘導THP-1細胞分化

根據(jù)細胞生長狀態(tài)和形態(tài)取2～4代細胞進行實驗。收集形態(tài)典型、生長狀態(tài)良好的THP-1進行實驗[THP-1細胞呈單個圓形懸浮，密度約(5～10)×106/ml，分布均勻，折光度較好]。THP-1細胞使用含有10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%雙抗(青霉素和鏈霉素配制)的1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每12～16 h觀察一次。待細胞到達對數(shù)生長期時(培養(yǎng)約24～36 h后)，用1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為6×105個/孔接種于6孔板中，加入PMA，調(diào)整PMA最終濃度依次為0、10、20、50、100、200 ng/ml，最后補充1640培養(yǎng)基至2 ml，以0 ng/ml PMA孔作為陰性對照孔。培養(yǎng)24 h后觀察各孔細胞貼壁、形態(tài)變化情況并攝影。當細胞形態(tài)由單個圓形懸浮細胞，逐漸變?yōu)橘N壁、形態(tài)不規(guī)則并伸出偽足，綜合觀察比較各孔分化形態(tài)和分化比例，以確定PMA誘導THP-1分化的優(yōu)化濃度，以分化細胞比例大的和巨噬細胞形態(tài)典型的為優(yōu)。確定最優(yōu)PMA濃度后，使用此PMA濃度分別誘導THP-1細胞0、24、48、60 h后再次觀察各孔細胞形態(tài)變化并攝影，綜合觀察比較各孔分化形態(tài)和分化比例，以確定PMA誘導THP-1分化的優(yōu)化作用時間，其中0 h作用孔作為陰性對照孔。細胞培養(yǎng)嚴格無菌操作，若有污染則棄去細胞，重新復蘇。

(二)細胞的轉(zhuǎn)染與篩選

1．YFP-LC3質(zhì)粒DNA的制備：首先使用本室保存的構(gòu)建好的質(zhì)粒(pcDNA3.1-YFP-LC3質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α，然后將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細菌DH5α均勻涂在含卡那霉素的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，干燥后，倒置平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h。挑取單克隆菌落經(jīng)鑒定后進行擴大培養(yǎng)。收集菌液，使用去內(nèi)毒素法，按照E.Z.N.A. EndoFree Plasmid Mini Kit說明書步驟提取YFP-LC3質(zhì)粒，NanoDrop 2000分光光度計測定濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆?。YFP為黃綠色熒光蛋白，本研究用表達融合蛋白YFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，以示蹤自噬體的形成。

2．THP-1細胞的轉(zhuǎn)染：脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染YFP-LC3質(zhì)粒至THP-1細胞。使用無抗生素培養(yǎng)基以2.5×105個/孔密度接種THP-1細胞至24孔細胞培養(yǎng)板，加入培養(yǎng)基至500 μl。使用100 ng/ml的PMA誘導THP-1細胞48 h，設(shè)置未加入PMA孔作為陰性對照。當細胞形態(tài)由單個圓形懸浮細胞，逐漸變?yōu)橘N壁、形態(tài)不規(guī)則并伸出偽足，認為THP-1已分化為巨噬細胞。當細胞分化為貼壁的巨噬細胞、判斷貼壁細胞占孔板達到90%～95%時進行后續(xù)操作。具體的操作嚴格按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000的操作說明書進行。

(三)細胞自噬的檢測

1.YFP-LC3點聚集示蹤自噬體的形成：Earle’s balanced salts solution(EBSS，又稱饑餓培養(yǎng)基)，可誘導多種細胞發(fā)生自噬。將細胞進行如下處理：先用優(yōu)化的PMA作用濃度和作用時間誘導THP-1分化為巨噬細胞，再分別收集未轉(zhuǎn)染YFP-LC3質(zhì)粒THP-1細胞、轉(zhuǎn)染YFP-LC3質(zhì)粒THP-1細胞及轉(zhuǎn)染后用EBSS處理的THP-1細胞(即用饑餓培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h后，再換成普通培養(yǎng)基)，利用熒光顯微鏡觀察黃綠色熒光及YFP-LC3點聚集在細胞中的分布情況并攝影。

2.RT-qPCR檢測自噬相關(guān)基因：收集上述三組細胞，PBS洗2次后，使用TRIzol?Reagent裂解細胞，具體操作嚴格按照TRIzol?Reagent說明書步驟進行。以 NanoDrop 2000分光光度計進行濃度測定和純度判斷，A260/280在1.9～2.1之間，可認為RNA純度較好[5]。根據(jù)First-Strand cDNA synthesis M-MLV Kit說明書進行cDNA的合成，使用20 μl反應體系，以β-actin和GAPDH作為內(nèi)參擴增相關(guān)基因(引物序列見表1)，其中β-actin、GAPDH、LC3基因上下游引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，Beclin1、Atg5、Atg7基因上下游引物參考文獻[9]進行設(shè)計。反應步驟為: 94 ℃，2 min預變性；94 ℃，15 s變性；58 ℃，30 s退火；68 ℃，1 min延伸，共40個循環(huán)。使用比較Ct值法(2-ΔΔCt)方法進行mRNA表達差異分析。自噬相關(guān)基因LC3、Beclin1、Atg5、Atg7基因mRNA的表達增加，可在一定程度上提示自噬通量增強。

表1 不同目的基因的熒光定量PCR引物序列

注F:正向引物；R：反向引物

(四)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理

三、相關(guān)定義

1.自噬通量：指自噬的完整過程，包括底物向溶酶體的傳送及其后續(xù)分解和回收利用等。

2.比較Ct值法：Ct值法是基因表達調(diào)控研究中最常用的兩種相對定量方法之一。該方法同時擴增目的基因片段和內(nèi)參基因片段，一般設(shè) 1～2個內(nèi)參基因。比較Ct值法與標準曲線法的相對定量的不同之處在于其運用了數(shù)學公式來計算相對量，前提是假設(shè)每個循環(huán)增加1倍的產(chǎn)物數(shù)量，在PCR反應的指數(shù)期得到Ct值來反應起始模板的量，一個循環(huán)的不同相當于起始模板數(shù)2倍的差異[10]。測得兩者的Ct值之差，即2-ΔΔCt。通過擴增標準曲線判斷擴增效率，通過數(shù)學公式來計算相對量。本研究通過比較 Ct值法的相對定量來評價細胞自噬相關(guān)基因mRNA表達量的變化。

結(jié) 果

一、THP-1誘導分化的條件優(yōu)化

為獲得THP-1源性巨噬細胞(MΦ)，本研究優(yōu)化了THP-1細胞分化成MΦ的誘導條件。筆者采用0、10、20、50、100、200 ng/ml不同濃度PMA誘導分化細胞24 h，并用同一濃度PMA誘導THP-1細胞0、24、48、60 h(圖1，2)。結(jié)果顯示，未加入誘導劑PMA時，觀察細胞形態(tài)無明顯變化，即幾乎沒有細胞被誘導分化貼壁(圖1A，圖2A)；隨著PMA誘導濃度增加，THP-1分化為MΦ比例增多，即細胞形態(tài)由單個圓形懸浮細胞，逐漸變?yōu)橘N壁、形態(tài)不規(guī)則并伸出偽足(圖1B～E)。同一濃度PMA刺激時，隨著誘導時間的增加，貼壁細胞增多(圖2B～D)。綜合分析發(fā)現(xiàn)，在PMA濃度為100 ng/ml和誘導時間24～48 h之間時，細胞貼壁最多，形態(tài)不規(guī)則且偽足明顯，即巨噬細胞樣細胞狀態(tài)最理想(圖3)，故選擇此條件為PMA誘導THP-1細胞分化的最佳條件。

A：0 ng/ml(對照組)；B：20 ng/ml；C：50 ng/ml；D：100 ng/ml；E：200 ng/ml圖1 倒置顯微鏡觀察不同濃度PMA誘導THP-1 24 h的分化情況(直接可見光下觀察，×100)

A：0 h(對照組)；B：12 h；C：48 h；D：60 h圖2 倒置顯微鏡觀察100 ng/ml PMA誘導THP-1不同作用時間的分化情況(直接可見光下觀察，×100)

二、熒光顯微鏡觀察YFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至THP-1源性MΦ

結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染YFP-LC3質(zhì)粒的細胞未見熒光發(fā)出，而轉(zhuǎn)染YFP-LC3質(zhì)粒的巨噬細胞可見熒光發(fā)出，說明YFP-LC3質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染至THP-1源性的巨噬細胞，可用于后續(xù)示蹤自噬的檢測(圖4 A、B)。THP-1分化的MΦ經(jīng)EBSS處理后，LC3點聚集現(xiàn)象增強，提示EBSS增加了自噬通量(圖4C)。

三、RT-qPCR檢測EBSS誘導MΦ后LC3、Atg5、Atg7、Beclin1的mRNA表達水平

使用EBSS誘導細胞后，用RT-qPCR檢測自噬相關(guān)基因的mRNA表達水平，以檢測EBSS是否可誘導THP-1源性巨噬細胞發(fā)生自噬。結(jié)果提示，EBSS處理PMA誘導THP-1分化的巨噬細胞后，自噬相關(guān)基因LC3、Atg5、Atg7、Beclin1的mRNA表達水平顯著增加， 2-ΔΔCt值均值分別為1.35±0.16、1.18±0.39、1.44±0.12、1.08±0.09，(t值分別為4.00、2.90、5.16、3.57，P值均<0.05)(圖5)，說明EBSS能明顯誘導THP-1源性MΦ細胞的自噬過程。

PMA濃度為100 ng/ml和誘導時間24～48 h之間時，細胞貼壁最多，形態(tài)不規(guī)則且偽足明顯，即巨噬細胞樣細胞狀態(tài)最理想圖3 倒置顯微鏡觀察100 ng/ml PMA誘導THP-1分化的巨噬細胞(直接可見光下觀察，×100)

討 論

“自噬”的概念由比利時科學家Christian de Duve 在1963年溶酶體國際會議上首先提出，是指細胞受到刺激后吞噬自身的細胞質(zhì)或細胞器, 最終將吞噬物在溶酶體內(nèi)降解的過程。廣義上的自噬包括巨自噬 (macroautophagy)、微自噬(micro-autophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperone- mediated autophagy,CMA)3種類型，通常所說的自噬指巨自噬。THP-1，即人類急性單核細胞白血病細胞，可被PMA誘導分化為MΦ，形態(tài)上由單個圓形的懸浮細胞分化為貼壁生長、形態(tài)不規(guī)則且伸出偽足的MΦ樣細胞[6]。THP-1源性MΦ屬于人類細胞系，是研究炎癥相關(guān)巨噬細胞功能的經(jīng)典細胞模型，也是研究Mtb與宿主細胞相互作用的常用細胞株[11-13]，且已用于結(jié)核分枝桿菌感染中自噬作用的研究[14-15]。然而，雖然由THP-1誘導分化的巨噬細胞是重要的工具細胞，但已往文獻報道中關(guān)于誘導劑PMA的誘導濃度和誘導時間存在較大差異，導致誘導條件不一致。PMA的誘導濃度從50～200 ng/ml不等，誘導時間跨度也達12～72 h，這可能受實驗中THP-1培養(yǎng)狀態(tài)、所用PMA的質(zhì)量和純度等的影響[6,12-13]，但THP-1誘導分化條件的不確定性，常常導致研究者對研究結(jié)果的質(zhì)疑，甚至引起同行爭議。因此，對THP-1細胞誘導分化條件的優(yōu)化是當前研究亟需解決的問題，統(tǒng)一、可靠的誘導條件是進行后續(xù)科學研究的堅實基礎(chǔ)。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了PMA對THP-1細胞的誘導分化條件，通過綜合分析PMA在不同誘導濃度和誘導時間下對THP-1的誘導作用，發(fā)現(xiàn)100 ng/ml的PMA誘導THP-1細胞24～48 h后分化形成的MΦ形態(tài)特征明顯，且狀態(tài)較好。因此，確定100 ng/ml PMA作用24～48 h是最佳誘導條件。

A：未轉(zhuǎn)染YFP-LC3質(zhì)粒的MΦ，B：轉(zhuǎn)染YFP-LC3質(zhì)粒的MΦ，C：EBSS處理轉(zhuǎn)染YFP-LC3質(zhì)粒的MΦ圖4 熒光顯微鏡觀察YFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至THP-1源性MΦ的情況(×100)

圖5 EBSS處理THP-1源性MΦ后自噬相關(guān)基因LC3、Atg5、Atg7、Beclin1的mRNA表達水平變化(t值分別為4.00、2.90、5.16、3.57，P值均<0.05)

在此誘導條件下，筆者還構(gòu)建了EBSS誘導THP-1源性MΦ的自噬模型，通過熒光顯微鏡觀察YFP-LC3點聚集示蹤自噬，發(fā)現(xiàn)經(jīng)EBSS培養(yǎng)基處理后，細胞發(fā)生自噬并增加了自噬通量。RT-qPCR對自噬相關(guān)基因(LC3、Atg5、Atg7、Beclin1)mRNA的表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)由EBSS處理后的MΦ細胞中自噬相關(guān)基因mRNA表達水平明顯增加。以上實驗結(jié)果均提示EBSS可增加THP-1源性MΦ的自噬通量。這部分實驗中有關(guān)鍵的兩點，分別是PMA的質(zhì)量和THP-1的生長狀態(tài)。對于誘導劑PMA，本研究采用的是Sigma的產(chǎn)品，制成的工作液避光保存于-20 ℃冰箱并在1個月內(nèi)用完。本研究中發(fā)現(xiàn)，只要操作者有熟練的細胞培養(yǎng)經(jīng)驗，選取對數(shù)生長期的細胞和合格質(zhì)量的PMA就能以穩(wěn)定的誘導條件得到巨噬細胞。

總之，本研究結(jié)合已有文獻報道，優(yōu)化了PMA誘導THP-1細胞分化的條件，為后續(xù)相關(guān)實驗提供了可靠的誘導條件。除此之外，筆者還構(gòu)建了較理想的自噬模型，為基于細胞自噬模型進行的實驗提供了科學依據(jù)。例如研究以細胞免疫為主的相關(guān)疾病的致病機制、機體免疫機制，常見應用于傳染性疾病(結(jié)核病等)、腫瘤等相關(guān)疾病的研究。

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