董小倩　劉西茜　張永紅等

[摘要] 目的 以人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Tca8113為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，初步探討高遷移率族蛋白N2（HMGN2）抗口腔鱗

狀細(xì)胞癌的作用。方法 大量培養(yǎng)重組人HMGN2表達(dá)載體大腸桿菌BL21，用異丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)HMGN2的表達(dá)，產(chǎn)物用B-PER GST Fusion Protein Purification Kit進(jìn)行純化。在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的HMGN2，通過(guò)MTT、Hoechst 33342熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)和Western-blot法檢測(cè)其凋亡效果及抗凋亡的分子機(jī)制。結(jié)果 經(jīng)MTT檢測(cè)證明HMGN2能顯著抑制Tca8113細(xì)胞的生長(zhǎng)，通過(guò)Hoechst 33342熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)和Western-blot檢測(cè)證明HMGN2能使Tca8113的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，并且能使Tca8113細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期的S期，促進(jìn)Tca8113細(xì)胞凋亡。結(jié)論 HMGN2可以促進(jìn)人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡。

[關(guān)鍵詞] 高遷移率族蛋白N2； 人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株； 凋亡

[中圖分類號(hào)] R 730.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.022 高遷移率族蛋白N2（high mobility group chro-

mosomal protein N2，HMGN2）屬于高遷移率族蛋白

（high mobility group chromosomal protein，HMG）三大家族成員之一，是一種進(jìn)化保守的非組蛋白，在脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物的細(xì)胞核中含量非常豐富[1]；其相對(duì)分子質(zhì)量約為9.2×103，由90個(gè)氨基酸殘基組成[2-3]。學(xué)者們[4-5]在人淋巴因子激活殺傷細(xì)胞（lym-phokine-activated killer cell，LAKC）和人宮頸液中分離純化抗菌肽的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，HMGN2在體外有較強(qiáng)的抗革蘭陰性菌和抗乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）活性。通過(guò)基因雜交的方法發(fā)現(xiàn)HMGN2多基

因家族中的功能基因僅有1個(gè)，位于染色體1p36。有研究[3]發(fā)現(xiàn)：1p區(qū)域具有多個(gè)腫瘤抑制基因，且1p36

區(qū)域的染色體異常與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，由此推測(cè)HMGN2可能具有抗腫瘤活性。本文主要研究其體外抗人口腔鱗狀細(xì)胞癌的功能。

1 材料和方法

1.1 材料

重組人HMGN2表達(dá)載體大腸桿菌BL21、人口腔

鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Tca8113（四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存）。B-PER GST Fusion Protein Purification Kit（Thermo公司，美國(guó)）、BCA Protein

AS Say Kit（Pierce公司，美國(guó)），改良型RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國(guó)），新生牛血清（上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司），MTT（Amreesco公司，美國(guó)），Hoechst 33342（Sigma公司，美國(guó)），Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、全蛋白試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.2 HMGN2蛋白的分離純化及其質(zhì)量濃度的測(cè)定

將重組人HMGN2表達(dá)載體大腸桿菌BL21接種

于固體Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑選單個(gè)菌落接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩過(guò)夜；以1∶1 000的體積比接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩6 h后加入異丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷（isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)過(guò)夜，離心收集細(xì)菌，每克菌加入3 mL含苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）的裂解液，冰上裂解20 min，超聲破碎菌體，4 ℃、1.4×104 r·min-1離心20 min，收集上清液過(guò)濾，過(guò)濾后的樣品經(jīng)B-PER GST Fusion Protein Purification Kit進(jìn)行純化，收集HMGN2蛋白并保存。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)描述的方法，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3 HMGN2蛋白對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖的抑制作用

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) Tca8113細(xì)胞用含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合達(dá)80%以上時(shí)用胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，RPMI1640培養(yǎng)基重懸。

1.3.2 HMGN2蛋白對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖的抑制作用 將消化好的Tca8113細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，PBS洗2次。用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋HMGN2至不同的質(zhì)量濃度，分別為0、1、2、2.5、3、4、5 μg·mL-1，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，將HMGN2與Tca8113細(xì)胞共培養(yǎng)，37 ℃作用2～3 h后再加含體積分?jǐn)?shù)為20%血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后用MTT法于酶標(biāo)儀上測(cè)定光密度（optical density，OD）值。以HMGN2的質(zhì)量濃度為橫軸，OD值為縱軸作圖，比較各組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.3.3 HMGN2蛋白對(duì)Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)的影響 將消化好的Tca8113細(xì)胞以每孔5×104個(gè)的密度接種于24孔板中，細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，PBS洗2次。用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋HMGN2至不同的質(zhì)量濃度，分別為0、1、2、3 μg·mL-1，將HMGN2與Tca8113細(xì)胞共培養(yǎng)，37 ℃作用2～3 h后加入含體積分?jǐn)?shù)為20%血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24、48、72、96 h后于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化。

1.3.4 Hoechst 33342熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將消化好的Tca8113細(xì)胞以每孔5×104個(gè)的密度接種于24孔板中，細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，PBS洗2次。用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋HMGN2至不同的質(zhì)量濃度，分別為0、1、2、3 μg·mL-1，將HMGN2與Tca8113細(xì)胞共培養(yǎng)，37 ℃作用2～3 h后加入含體積分?jǐn)?shù)為20%血清的培養(yǎng)基，孵育24 h后吸盡每孔的培養(yǎng)基，PBS洗2次后加入4%多聚甲醛200 μL固定3～5 min，PBS洗2次，加入200 μL質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的Hoechst 33342，避光反應(yīng)30 min，PBS洗2次后置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將消化好的Tca8113細(xì)胞以每孔5×105個(gè)的密度接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，PBS洗2次。用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋HMGN2至不同的質(zhì)量濃度，分別為0、1、2、3 μg·mL-1，將HMGN2與Tca8113細(xì)胞共培養(yǎng)，37 ℃作用2～3 h后加入含體積分?jǐn)?shù)為20%血清的培養(yǎng)基，24 h后收集細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡，操作按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.6 HMGN2蛋白對(duì)Tca8113細(xì)胞周期的影響 將消化好的Tca8113細(xì)胞以每孔5×105個(gè)的密度接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，PBS洗2次。用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋HMGN2至不同的質(zhì)量濃度，分別為0、1、2、3 μg·mL-1，將HMGN2與Tca8113細(xì)胞共培養(yǎng)，37 ℃作用2～3 h后加入含20%血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，操作按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.7 Western-blot法檢測(cè)Tca8113細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá) 取2瓶生長(zhǎng)良好的Tca8113細(xì)胞，棄去原培養(yǎng)基，PBS洗2次。用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋HMGN2至不同的質(zhì)量濃度，分別為0、2 μg·mL-1，將HMGN2與Tca8113細(xì)胞共培養(yǎng)，37 ℃作用2～3 h后加入含體積分?jǐn)?shù)為20%血清的培養(yǎng)基。24 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)凋亡蛋白的表達(dá)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白，然后用Western-blot法檢測(cè)內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）、P53、Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)?？贵w采用鼠抗GAPDH（1∶1 000）、兔抗P53（1∶500）、兔抗Bax（1∶500）、兔抗Bcl-2（1∶500）、兔抗Caspase-3（1∶500）。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HMGN2蛋白對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖的抑制作用

不同質(zhì)量濃度HMGN2作用后的細(xì)胞增殖情況見(jiàn)

組的差異即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），隨著HMGN2質(zhì)量濃度的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。

2.2 HMGN2蛋白對(duì)Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)的影響

不同質(zhì)量濃度的HMGN2作用后培養(yǎng)不同的時(shí)間，Tca8113細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化見(jiàn)圖2：與對(duì)照組（0 μg·mL-1）相比，1 μg·mL-1 HMGN2組的細(xì)胞數(shù)量即出現(xiàn)明顯減少；隨著HMGN2質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量減少更為明顯，HMGN2的抑制作用逐漸增強(qiáng)；同時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)異常，出現(xiàn)核濃縮、碎裂，有凋亡小體形成。隨著HMGN2質(zhì)量濃度和培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞逐漸死亡。

2.3 Hoechst 33342熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

Hoechst 33342熒光染色法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3：對(duì)照組（0 μg·mL-1）細(xì)胞核基本不著色，HMGN2組細(xì)胞呈

強(qiáng)熒光染色，說(shuō)明HMGN2組細(xì)胞膜對(duì)Hoechst 33342攝取增高、結(jié)合增強(qiáng)，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡；隨著HMGN2質(zhì)量濃度的增加，凋亡的細(xì)胞逐漸增多；3 μg·mL-1 HMGN2組染色細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，是因?yàn)榇罅考?xì)胞死亡，而死亡細(xì)胞不被Hoechst 33342染色所致。

2.4 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞

凋亡率

Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4：對(duì)照組細(xì)胞的早期凋亡率為2.7%，總凋亡率為4.9%；1、2、3 μg·mL-1 HMGN2組的早期凋亡率分別為11.2%、36.9%、59.5%，總凋亡率分別為17.6%、64.7%、77.0%；與對(duì)照組比較，細(xì)胞的凋亡率隨著HMGN2質(zhì)量濃度的增加而升高（P<0.05）。

2.5 HMGN2蛋白對(duì)Tca8113細(xì)胞周期的影響

HMGN2蛋白作用后Tca8113細(xì)胞的生長(zhǎng)周期檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5：隨著HMGN2質(zhì)量濃度的增加，S期細(xì)胞所占比例逐漸增加，G0/G1和G2/M期細(xì)胞的比例逐漸減少，提示HMGN2阻滯Tca8113細(xì)胞于S期。

2.6 Western-blot法檢測(cè)Tca8113細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

Tca8113細(xì)胞經(jīng)HMGN2蛋白作用后，細(xì)胞總蛋白中凋亡促進(jìn)蛋白Bax和P53表達(dá)量增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2和Caspase-3表達(dá)量減少（圖6）。該結(jié)果提示HMGN2可以導(dǎo)致Tca8113細(xì)胞的凋亡。

3 討論

目前HMG蛋白分為三大家族：HMGA、HMGB、HMGN。HMGN2屬于HMGN蛋白亞家族。HMGN蛋白亞家族具有典型的功能結(jié)構(gòu)域即核糖體結(jié)合域（nu-cleosomal binding domain，NBD），可將蛋白質(zhì)錨定于核小體的中心[1]。這類蛋白質(zhì)包括一個(gè)強(qiáng)勢(shì)的N-

末端區(qū)域，具有對(duì)核轉(zhuǎn)運(yùn)和核小體結(jié)合分別起作用的核定位信號(hào)區(qū)（nuclear localization signal，NLS）和

NBD[6-7]，具有高度保守的結(jié)構(gòu)，因其C-末端是酸性的，目前認(rèn)為在利于轉(zhuǎn)錄的高階染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重排中起著重要的作用[6，8-9]。研究[10-11]顯示，HMGN2可能具有更復(fù)雜的功能。Spieker等[3]對(duì)25株腫瘤細(xì)胞進(jìn)行

了分析，發(fā)現(xiàn)人染色體1p區(qū)域具有多個(gè)腫瘤抑制基因，如CHD5（chromodomain helicase DNA-binding

protein5）、RUNX3（runt related transcription factor

3）等；1p36這一區(qū)域的染色體異常與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，HMGN2基因恰恰定位于此，提示該分子可能具有抗腫瘤活性。Porkka等[11]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，HMGN2的N-末端31個(gè)氨基酸殘基能結(jié)合骨髓上皮原生細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞。由此可見(jiàn)，探討HMGN2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的功能和機(jī)制意義重大。

本實(shí)驗(yàn)用MTT法檢測(cè)出HMGN2對(duì)Tca8113細(xì)胞的半數(shù)致死量為2 μg·mL-1，因此選擇HMGN2的質(zhì)量濃度為0、1、2、3 μg·mL-1。經(jīng)Hoechst 33342熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HMGN2可促進(jìn)Tca8113細(xì)胞凋亡，且有劑量依賴關(guān)系，隨著HMGN2質(zhì)量濃度的增加，Tca8113細(xì)胞的凋亡率也逐漸增高，尤其HMGN2為3 μg·mL-1時(shí)，出現(xiàn)了大量的死亡細(xì)胞。經(jīng)細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HMGN2作用于Tca8113細(xì)胞后，阻滯其于S期。有文獻(xiàn)[12]報(bào)道，沉默ORAOV1（oral

cancer overexpressed 1）基因是通過(guò)抑制DNA復(fù)制

和調(diào)節(jié)相關(guān)周期蛋白（如cyclin A、cyclin B1和cdc2等）的表達(dá)而阻滯Tca8113細(xì)胞于S期的。HMGN2對(duì)

Tca8113細(xì)胞周期阻滯的相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。HMGN2主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而殺傷細(xì)胞。凋亡主要通過(guò)兩條信號(hào)通路進(jìn)行[13-14]，一條是線粒體途

徑即內(nèi)在途徑，另一條是死亡受體途徑即外在途徑。在內(nèi)在途徑中，P53通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；Bcl-2通過(guò)抑制細(xì)胞色素C的釋放而抑制細(xì)胞凋亡；Bax是與Bcl-2位于同一信號(hào)通路，但與其作用相反的凋亡促進(jìn)蛋白。Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，HMGN2可以通過(guò)內(nèi)在途徑導(dǎo)致Tca8113細(xì)胞凋亡[15]，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，HMGN2對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。目前治療腫瘤方法如放化療的不良反應(yīng)較大，HMGN2是存在于人淋巴細(xì)胞中的天然蛋白，能在很大程度上減少耐藥性及不良反應(yīng)，有望作為抗腫瘤藥物用于臨床，但仍需進(jìn)行深入研究。

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（本文編輯 吳愛(ài)華）