柳 茜，王清酈，傅 平，孫啟忠，敖學(xué)成

（1.四川省涼山州畜科所，四川 西昌 615042；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

光葉紫花苕（Vicia villosavar.glabresens）為一年生草本植物，原產(chǎn)于美國俄勒岡州，20世紀(jì)40年代自美國引進(jìn)南京，現(xiàn)廣泛種植于安徽、山東、河南、湖北、云南、四川、貴州等省［1］。光葉紫花苕適應(yīng)性廣，耐寒，耐旱，在田間、果園、山坡、生荒地上均可種植［2］。光葉紫花苕具有較高的飼用價值，粗蛋白含量在20%以上，氨基酸、礦物質(zhì)、維生素含量比較豐富，是牛、豬、雞的優(yōu)質(zhì)飼料［3－7］。此外，光葉紫花苕還是良好的綠肥和覆蓋作物，能改良土壤肥力，提高土壤固氮能力以及后續(xù)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)［8，9］，同時也是良好的蜜源植物［2］。涼山光葉紫花苕（Vicia villosavar.glabresenscv.Liangshan）是涼山州從云南引進(jìn)的光葉紫花苕在長期推廣中選育出的地方品種，適應(yīng)性強，在海拔2 500～3 200m的地區(qū)都能種植［3］，是高寒山區(qū)冬春季節(jié)的優(yōu)質(zhì)牧草。

種子貯藏蛋白是植物體中一類表達(dá)率高、能在種子內(nèi)大量積累且不易降解的蛋白質(zhì)［10］。貯藏蛋白可分為醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白等，這些蛋白質(zhì)的組成由遺傳決定，不受環(huán)境影響，其組分上的差異可以反映出基因型的不同，因而被稱為品種的生化“指紋”［11］。研究種子貯藏蛋白的方法有多種，其中蛋白質(zhì)電泳譜帶具有較高的多態(tài)性、專一性和穩(wěn)定性，在植物的遺傳生化標(biāo)記、品種鑒定、種群（居群）間的遺傳變異以及遺傳結(jié)構(gòu)的研究等方面得到廣泛應(yīng)用［12，13］。試驗采用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）技術(shù)對涼山州境內(nèi)5個居群的光葉紫花苕的種子貯藏蛋白進(jìn)行研究，從生化水平上探討涼山光葉紫花苕的遺傳多樣性，為涼山州種質(zhì)資源的研究和開發(fā)利用提供技術(shù)參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料采自涼山州境內(nèi)的西昌、鹽源、普格、普格小興場和德昌5個地區(qū)光葉紫花苕的自然居群。每個居群隨機選取5個單株混合作為該居群的樣品。各居群的生態(tài)因子情況見表1。

1.2 試驗方法

參照文獻(xiàn)［14］SDS－PAGE垂直平板電泳方法，分別對各居群種子貯藏蛋白（清蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和鹽溶蛋白）及總貯藏蛋白進(jìn)行電泳，并分析其多態(tài)性。

表1 光葉紫花苕居群的樣品來源Table 1 The Source of Vicia villosa Roth var.glabrescens cv.Liangshan samples

1.2.1 種子貯藏蛋白的提取 取10粒種子洗凈擦干，放入研缽中研碎，置于1.5mL離心管中，加入蛋白提取液［15－18］。

①清蛋白提取液：去離子水500μL。

②鹽溶蛋白提取液：加200μL脫脂劑（氯仿∶甲醇∶丙酮＝2∶1∶1），振蕩混勻，脫脂2h（室溫），10 000 r/min離心10min，棄上清液后風(fēng)干，加入500μL鹽溶蛋白提取液（0.25mmol/L Na3PO4、2mol/L NaCl，pH ＝7.0）。

③醇溶蛋白提取液：75%乙醇溶液500μL。

④谷蛋白提取液：0.2%NaOH溶液500μL。

⑤貯藏蛋白提取液：5mL 10%SDS，1.5mL 2－ME，1.25g溴酚蘭，3.44mL 甘油，2.0mL 1mol/L Tris－Hcl pH 6.8，加雙蒸水定容到25mL；500μL。

室溫振蕩浸提2h，10 000r/min離心10min，取上清液置于4℃冰箱備用。以1∶1的比例加入上樣緩沖液，煮沸5min后點樣。

1.2.2 SDS－PAGE電泳 SDS－PAGE的濃縮膠濃度3%，分離膠濃度12%。各類貯藏蛋白及總的貯藏蛋白的上樣量10μL，標(biāo)準(zhǔn)蛋白D532S（分子量6.5～200 kDa），上樣量5μL，用北京六一電泳儀器廠DYZ－28B型電泳槽，濃縮時電壓恒壓200V，分離時電流恒流60 mA電泳，室溫下電泳7～8h至指示劑跑到距底部1cm處，電泳結(jié)束后剝下膠片，染色3～10h，脫色至條帶清晰為止，照相并進(jìn)行統(tǒng)計［18］。

1.3 統(tǒng)計分析

SDS－PAGE中蛋白單體分子量的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)，單體電泳遷移率與其蛋白單體分子量的關(guān)系為lgMW＝lgK－bm＝K1－bm。其中MW為蛋白單體分子量，m為蛋白單體遷移率，K，K1和b為常數(shù)。相對遷移率（Rf）＝脫色后蛋白質(zhì)移動距離×染色前分離膠長/染色前指示劑移動距離×脫色后分離膠長。根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Marker）在相同電流條件下的遷移率，作出分子量和遷移率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計算出待測蛋白單體的分子量。

根據(jù)電泳結(jié)果對清晰蛋白質(zhì)條帶的有無進(jìn)行標(biāo)記，有為1，無為0，得出（0，1）矩陣。利用 Popgene 1.31軟件進(jìn)行Nei’s遺傳距離（D）和遺傳一致度（I）分析。利用NTSYS－pc 2.1系統(tǒng)進(jìn)行聚類分析［19］。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏蛋白譜帶遺傳多樣性分析

利用SDS－PAGE對5個不同居群的光葉紫花苕種子貯藏蛋白進(jìn)行電泳，獲得清晰穩(wěn)定的遺傳蛋白圖譜（圖1）。

圖1 5個不同居群光葉紫花苕的貯藏蛋白電泳圖譜Fig.1 Electrophoregrams of seed storage proteins of 5 populations of Vicia villosa var.glabrescens cv.Liangshan

5個居群之間的貯藏蛋白譜帶存在差異，共檢測到31條蛋白譜帶，其中，11條譜帶為共有帶，包括第3號、7號、8號、14 號、16 號、22 號 、25 號 、26 號、28 號、30號、31號；其余20條為不同程度表達(dá)的多態(tài)性譜帶，多態(tài)性數(shù)目占總條帶的65.52%。西昌居群有19條帶，鹽源居群有22條帶，普格小興場居群有20條帶，普格居群有17條帶，德昌居群有22條帶。普格小興場居群有1條特有帶，德昌居群有8條特有帶。譜帶分子量在11.09～100.09kDa，相對遷移率在0.16～0.84。根據(jù)譜帶相對遷移率由小到大（分子量由大到?。?，將種子貯藏蛋白圖譜分為α、β、γ、ω區(qū)域。其中α區(qū)相對遷移率為0.7～1.0，β區(qū)相對遷移率為0.3～0.7，γ區(qū)相對遷移率為0.1～0.3，ω區(qū)相對遷移率為0～0.1。貯藏蛋白只在α、β、γ區(qū)域有條帶出現(xiàn)，其中α區(qū)有6條，β區(qū)有19條，γ區(qū)有6條，ω區(qū)無譜帶出現(xiàn)，表明光葉紫花苕種子貯藏蛋白主要集中在β區(qū)。

表2 5個不同居群光葉紫花苕貯藏蛋白電泳各譜帶的遷移率和蛋白分子量Table 2 Frequency of bands and molecular weight of seed storage proteins of 5populations of Vicia villosa var.glabrescens cv.Liangshan

光葉紫花苕5個居群貯藏蛋白的Nei’s的遺傳距離和遺傳一致度見表3，西昌與鹽源居群、普格小興場與普格居群的遺傳距離最小，均為0.101 8，普格小興場與德昌居群遺傳距離最大，為0.869 0；普格小興場與德昌居群遺傳一致度最小，為0.419 4，西昌與鹽源居群、普格小興場與普格居群的遺傳一致度最大，為0.903 2。

5個居群的貯藏蛋白譜帶遺傳相似系數(shù)在0.13～0.90，平均達(dá)0.60，遺傳相似性較高，表明遺傳多樣性較低，遺傳基礎(chǔ)較窄。居群1與2、3與4譜帶相似系數(shù)最高，達(dá)到0.90，說明居群間親緣關(guān)系較近；居群5與1、2、3、4號居群的遺傳相似系數(shù)小，分別為0.21、0.27、0.13、0.34，表明居群間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。從聚類分析結(jié)果可以看出（圖2），在遺傳相似系數(shù)為0.47時5個居群分為2大類，第1類為1、2、3、4號居群，5號居群單獨聚為1類。

表3 貯藏蛋白Nei’s遺傳一致度（右上角）和遺傳距離（左下角）Table 3 Nei＇s of genetic identity and genetic distance of seed storage proteins

圖2 5個居群光葉紫花苕的貯藏蛋白聚類圖Fig.2 Dendrogram based on Nei’s genetic distance of 5populations of Vicia villosa var.glabrescens cv.Liangshan

2.2 鹽溶蛋白譜帶遺傳多樣性分析

5份供試材料的鹽溶蛋白譜帶存在差異，共檢測出22條蛋白譜帶，其中13條譜帶為穩(wěn)定表達(dá)譜帶，表達(dá)率為100%；其余9條為不同程度的多態(tài)性譜帶，多態(tài)性數(shù)目占總條帶的40.92%（圖3）。5（德昌居群）有8號、14號兩條特有譜帶，1（西昌居群）有17號1條特有譜帶。其中α區(qū)有5條，β區(qū)有12條、γ區(qū)有5條，ω區(qū)無譜帶出現(xiàn)，分子量大小13.50～95.04kDa（表4）。

5個不同居群光葉紫花苕鹽溶蛋白的Nei’s的遺傳距離和遺傳一致度見表5，2（鹽源居群）與4（普格居群）的遺傳距離為0最小，5（德昌居群）與2（鹽源居群）、4（普格居群）的遺傳距離最大，為0.452 0；5（德昌居群）與2（鹽源居群）、4（普格居群）的遺傳一致度最?。?.636 4），4（普格居群）與2（鹽源居群）的遺傳一致度最大（1.000 0）。

圖3 5個不同居群光葉紫花苕的鹽溶蛋白電泳圖譜Fig.3 Electrophoregrams of salt－soluble proteins of 5populations of Vicia villosa var.glabrescens cv.Liangshan

表4 5個不同居群光葉紫花苕鹽溶蛋白電泳各譜帶的遷移率（Rf）和蛋白分子量Table 4 Frequency of bands and molecular weight of salt－soluble proteins of 5populations of Vicia villosa var.glabrescens cv.Liangshan

表5 鹽溶蛋白Nei’s遺傳一致度（右上角）和遺傳距離（左下角）Table 5 Nei＇s of genetic identity and genetic distance of salt－soluble proteins

5個居群的鹽溶蛋白譜帶遺傳相似系數(shù)在0.55～1.00，平均達(dá)0.78，譜帶相似系數(shù)最高的是居群2與4，達(dá)到1.00，居群間親緣關(guān)系最近；居群5與2、4號居群的遺傳相似系數(shù)較低，為0.55，居群間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。從聚類分析結(jié)果可以看出（圖4），在遺傳相似系數(shù)為0.66時5個居群分為2大類，第1大類又可分2個亞類，2、3、4號居群聚為1類，1號居群單獨為1類。5號居群單獨聚為第2大類。

2.3 清蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白電泳結(jié)果

經(jīng)電泳染色脫色后，點樣孔加入醇蛋白的泳道無清晰譜帶出現(xiàn)，點樣孔加入清蛋白、谷蛋白的泳道中出現(xiàn)幾條痕跡很淺的條帶，由于蛋白含量過少故對此不做過多討論。

圖4 5個不同居群光葉紫花苕的鹽溶蛋白聚類圖Fig.4 Dendrogram based on Nei’s genetic distance of 5 Vicia villosa var.glabresens cv.Liangshan

3 討論與結(jié)論

SDS－PAGE凝膠電泳的電泳速度與蛋白分子量大小有關(guān)而與電荷和形狀無關(guān)。因其具有電泳結(jié)果穩(wěn)定、不受貯藏年限和外界環(huán)境影響等優(yōu)點而得到廣泛應(yīng)用［20］。李擁軍等［20］利用SDS－PAGE方法對我國18個苜蓿地方品種和北美9個苜蓿基本種質(zhì)來源的代表品種及14份豆科牧草種（品種）種子貯藏蛋白進(jìn)行了分析，結(jié)果表明貯藏蛋白譜帶差異較小；閆偉紅等［21］對引種栽培篩選出的5種12個冰草屬植物居群醇溶蛋白進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)同一物種不同來源材料間遺傳差異較小。

對5個不同居群光葉紫花苕的蛋白電泳譜帶進(jìn)行統(tǒng)計，不同提取液所獲得的蛋白譜帶各不相同。其中使用75%乙醇溶液提取的種子醇溶蛋白含量甚微或無，使用去離子水和0.2%NaOH溶液提取的種子清蛋白和谷蛋白只出現(xiàn)幾條痕跡很淺的條帶。利用鹽溶蛋白和貯藏蛋白提取液所得的總蛋白譜帶的分子量介于11.09～100.09kDa，相對遷移率在0.17～0.90。鹽溶蛋白的蛋白譜帶總數(shù)為22條，多態(tài)率為40.92%；貯藏蛋白的為31條，多態(tài)率為65.52%，說明5個居群的鹽溶蛋白的條帶位點少于貯藏蛋白，種內(nèi)變異小于貯藏蛋白。聚類結(jié)果表明，利用鹽溶蛋白和貯藏蛋白獲得的蛋白質(zhì)圖譜能區(qū)分鑒別5個不同居群的光葉紫花苕。供試材料分為2類：1）西昌、鹽源、普格小興場、普格居群；2）德昌居群。表明同一物種不同生態(tài)居群的遺傳差異較小，與閆偉紅研究結(jié)果相似［21］。涼山光葉紫花苕具有較高的遺傳保守性，在不同生態(tài)區(qū)都能保持較穩(wěn)定的遺傳性，這可能與光葉紫花苕為自花授粉植物有關(guān)。德昌居群種子千粒質(zhì)量比其他居群小，但植物學(xué)特性表現(xiàn)一致，是否是光葉紫花苕新類型，還需要結(jié)合其他手段做進(jìn)一步的研究證明。

［1］中國農(nóng)業(yè)百科全書總編輯委員會農(nóng)作物卷編輯委員會.中國農(nóng)業(yè)百科全書·農(nóng)作物卷上［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1991：214.

［2］中國農(nóng)業(yè)百科全書總編輯委員會養(yǎng)蜂卷編輯委員會.中國農(nóng)業(yè)百科全書養(yǎng)蜂卷［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1993：112.

［3］全國牧草品種審定委員會.中國牧草登記品種集［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1999：181.

［4］趙庭輝，李樹清，鄧秀才.高海拔地區(qū)光葉紫花苕不同生育時期的營養(yǎng)動態(tài)及適宜利用期［J］.中國草食動物，2010，30（3）：4－6.

［5］鄒文能，董建強，朱輝鴻，等.試論光葉紫花苕在高寒貧困山區(qū)的推廣應(yīng)用［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，44（1）：13－15.

［6］楊玉能，夏先林，田茂林.用紫花苕代替育肥肉牛精料中豆粕試驗［J］.草業(yè)科學(xué)，2010，10（24）：56－71.

［7］王德鳳，徐國錄，周鵬，等.光葉紫花苕對雜交肉牛生長代謝的影響研究［J］.貴州畜牧獸醫(yī)，2010，34（5）：7－9.

［8］侶國涵，吳文昊，梅東海，等.不同光葉紫花苕子翻壓量對烤煙產(chǎn)量和品質(zhì)的影響［J］.中國煙草科學(xué)，2011，10（32）：82－86.

［9］卯升華，董恩省，彭瑤.光葉紫花苕對土壤肥力及后續(xù)作物產(chǎn)量的影響［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007（11）：102－104.

［10］胡志昂，王洪新.蛋白質(zhì)多樣性和品種鑒定［J］.植物學(xué)報，1991，33（7）：556－2564.

［11］蘭海燕，李立會.蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù)在作物品種鑒定中的應(yīng)用［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（8）：916－920.

［12］夏蘭琴，蔣尤泉，閻福林.扁蓿豆遺傳多樣性的研究［J］.中國草地，1997（2）：30－35.

［13］郭江波，趙來喜.中國苜蓿育成品種遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究［J］.中國草地，2004，26（1）：9－14.

［14］汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，2008.

［15］趙楊，駢瑞琪，陳曉陽，等.二色胡枝子種子儲藏蛋白多樣性研究［J］.西北植物學(xué)報，2007，27（9）：1767－1771.

［16］孫雁，朱有勇，朱永平，等.蛋白質(zhì)電泳在豌豆品種鑒定中的應(yīng)用［J］.種子，2004，23（2）：24－26.

［17］毛小濤，王照蘭，杜建材，等.不同品系扁蓿豆種子蛋白指紋圖譜研究［J］.中國草地學(xué)報，2009，31（6）：45－51.

［18］閆偉紅，徐柱，師文貴，等.胡枝子屬植物40個野生居群種子蛋白譜帶多樣性研究［J］.草業(yè)科學(xué)，2007，24（5）：58－63.

［19］朱長志，賴德強，吳斌，等.利用種子蛋白SDS－PAGE技術(shù)進(jìn)行抗熱蘿卜種質(zhì)鑒定［J］.中國蔬菜，2010（8）：21－25.

［20］李擁軍，蘇加楷.中國苜蓿地方品種親緣關(guān)系的研究［J］.草業(yè)學(xué)報，1999，8（1）：31－41.

［21］閆偉紅，徐柱，李臨杭，等.冰草屬植物醇溶蛋白遺傳分析與評價［J］.草原與草坪，2010，30（1）：1－6.