馬清河，薛 剛，秦艷梅，劉麗娜

（河北省科學(xué)院微生物研究所，河北 保定 071051）

清洗劑類產(chǎn)品借助酶，其低溫、節(jié)能、省時(shí)、節(jié)水和安全、無(wú)害的性能獲得了全面提升。目前含有多種酶的清洗劑在器械的清洗上開始被廣泛采用，但市場(chǎng)上的含酶器械清洗劑質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)均不一致［1］，尤其是多酶種類的采用，很少有對(duì)其各酶之間的相互影響進(jìn)行深入研究，而很多研究［2］、［3］指出，必須解決各酶制劑一致性的問(wèn)題，否則不同酶的適用條件會(huì)造成酶混合后相互影響的矛盾，有可能會(huì)降低了其應(yīng)用價(jià)值，難以得到推廣應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)利用對(duì)清洗有效果的淀粉酶（amylase）、蛋白酶（proteinase）［4］進(jìn)行配伍，通過(guò)對(duì)二者的相容性、穩(wěn)定性等方面的考察，為器械清洗合理用酶提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

（1）主要材料：醫(yī)用攝子、止血鉗、剪刀、手術(shù)刀、柄，為市售?？莶菅挎邨U菌（Bacillas subtilis）產(chǎn)的淀粉酶（2000u／g）和蛋白酶（80000u／g），為本實(shí)驗(yàn)室保存。

（2）主要試劑：3，5－二硝基水楊酸，葡萄糖，3，5－二硝基水楊酸（DNS）顯色液，碘化鉀、二氯化汞、氫氧化鉀、氯化銨、酒石酸鉀鈉、甲醛、L－谷氨酰胺均為分析純。

（3）主要儀器：SP－721E分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；202型恒溫培養(yǎng)箱 余姚市東方電工儀器廠；H－4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；ZDX－35D高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；78－1型磁力攪拌器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FA2004N型電子分析天平上海精密科技儀器有限公司；E－201－C型pH計(jì) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

（1）酶的配伍：按淀粉酶活力（u／g）：蛋白酶活力（u／g）分別為1∶3、1∶9、1∶15、1∶21、1∶27分別復(fù)配，均用蒸餾水稀釋200倍，于5000r／min冷凍離心15min，取上清液在40℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）酶活力測(cè)定：參照文獻(xiàn)［5］中的“紫外光分光光度法”進(jìn)行。

（3）兩酶配伍后的相容性考察：取上述（1）中不同活力比值配伍的混合酶液各100mL于比色試管內(nèi)，用0.2M的磷酸鹽緩沖溶液調(diào)整各混合液pH＝7.0后，把各試管置于320℃的恒溫震蕩水浴鍋內(nèi)30min、60min、120min，分別取出觀察各試管有無(wú)分層、有無(wú)沉淀和渾濁等現(xiàn)象。

（4）兩酶配伍后的穩(wěn)定性考察：取上述（1）中不同活力比值配伍的混合酶液各100mL于比色試管內(nèi)，在其自然pH值狀態(tài)下，置于300℃恒溫箱內(nèi)，在15d、30d、60d、90d定期測(cè)定各酶的活力、觀察各試管有無(wú)沉淀和渾濁現(xiàn)象。

（5）蛋白污垢的清除能力：醫(yī)用器械在人為污染血液后，自然狀態(tài)下放置24h。取上述（1）中不同活力比值配伍的混合酶液各300mL于小托盤內(nèi)，用0.2M的磷酸鹽緩沖溶液調(diào)整各混合液pH＝7.0后，放置在300℃的恒溫震蕩箱中預(yù)溫5min，然后把污染的攝子、止血鉗、剪刀、手術(shù)刀等醫(yī)用器械放入浸泡10min。測(cè)定各液的蛋白質(zhì)含量增加率，用清水代替上述各混合酶液做對(duì)照。

2 結(jié)果

（1）配伍后混合酶液的活力表征：上述1.2（1）中不同活力比值配伍的混合酶液中各酶的活力如下表1。

表1 混合酶液中各酶的活力（u／mL）

（2）復(fù)配后各酶之間的相容性：在初始30min至60min內(nèi)，各試管中的混合酶液均為淺黃色液體，透明無(wú)分層，無(wú)沉淀；120min開始，除1∶27酶活力比值的試管外，其它試管均有渾濁的現(xiàn)象產(chǎn)生，1∶3酶活力比值的試管出現(xiàn)微量沉淀。

說(shuō)明蛋白酶與淀粉酶在混合后的液體狀態(tài)下，處于適宜的溫度和時(shí)間中，均會(huì)產(chǎn)生相互影響；而適宜的配比活力比值能使酶之間的相容性提高。

（3）復(fù)配后混合酶液的穩(wěn)定性：不同時(shí)間段各酶活力值見下表2。

表2 各時(shí)間段混合液中兩酶的活力值（u／mL）

表2可以看出，在液態(tài)中不論是何種酶，沒(méi)有加入穩(wěn)定劑的情況下，長(zhǎng)、短時(shí)間的放置其活力均下降；兩酶活力比值較大時(shí)，混合后的酶液穩(wěn)定性較好；兩酶活力比值較小時(shí)，混合后的酶液穩(wěn)定性較差。

從混合酶液外觀上，放置15d至60d左右，各混合酶液均產(chǎn)生渾濁，甚至有絮狀沉淀，而僅有個(gè)別的1∶27活力比值的混合酶液表現(xiàn)出微小的渾濁并保持了較好的透明無(wú)分層；90d后各混合液渾濁現(xiàn)象減輕趨于清澈、透明，但沉淀增加。

說(shuō)明蛋白酶對(duì)蛋白（淀粉酶就是活性蛋白）的作用是會(huì)必然發(fā)生的，環(huán)境條件（如狀態(tài)、溫度…）決定了作用的大小和快慢；混合酶液存放比單一酶液存放更易失活和變質(zhì)，但同時(shí)適宜的活力比值混合，反而能促進(jìn)淀粉酶與蛋白酶的配伍穩(wěn)定性。

（4）不同活力比值混合酶液對(duì)蛋白污垢的清除能力：各混合酶浸液中蛋白質(zhì)含量增長(zhǎng)情況見下圖1。

圖1 各混合液中蛋白質(zhì)的吸光度

從圖1可以看出，各混合酶液蛋白質(zhì)的吸光度大小順序?yàn)榍逅?∶15＜1∶3＜1∶21＜1∶9＜1∶27。

說(shuō)明淀粉酶和蛋白酶的混合液，對(duì)器械上蛋白污垢的去除能力并不和酶相對(duì)活力的大小呈正比，而是以適宜的混合活力比值有關(guān)。

3 討論

器械清洗劑中所含有的蛋白酶，會(huì)和淀粉酶及任何其它酶發(fā)生相互作用，其作用只是因條件因素而決定，如在本實(shí)驗(yàn)中的淀粉酶和蛋白酶的混合酶液，在較低溫度與短時(shí)間內(nèi)，沒(méi)有發(fā)生渾濁和沉淀現(xiàn)象，液體呈清澈透明狀，但并不說(shuō)明蛋白酶不會(huì)與淀粉酶作用；在較高（適宜）的溫度和較長(zhǎng)時(shí)間，該混合液均產(chǎn)生絮狀沉淀及渾濁，即說(shuō)明發(fā)生了相互作用現(xiàn)象。而器械清洗酶產(chǎn)品的使用均會(huì)在較高的溫度條件下進(jìn)行［6］，因此建議在研發(fā)類似混合酶產(chǎn)品時(shí)，應(yīng)以使用條件（如溫度）來(lái)考察酶之間的相容性。

多酶混合時(shí)，其各酶之間的配比濃度對(duì)其性能影響顯著［7］的觀點(diǎn)已得到共識(shí)，并在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也得到很好的論證。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以看出，液體中，多酶混合后的穩(wěn)定性在大多情況下較單一酶要小。但本實(shí)驗(yàn)中淀粉酶和蛋白酶活力比值越大，混合后的相容性及穩(wěn)定性越高，其機(jī)理需進(jìn)一步的研究。

［1］ 陶西萍，薛衛(wèi)寧，高艷霞.多酶清洗劑清洗效果簡(jiǎn)易檢測(cè)方法［J］.中國(guó)消毒學(xué)雜志，2011，28（6）：758－759.

［2］ E.Csiszar A.Losonezi B.Koezka，G.Szaka－csA.Pomlenyi.Degradationoflignin－eont－aini ngmaterialsbyxylanaseinbio Pre Parationofcotton［J］.BioteehnolLett，2006，（28）：749－753.

［3］ Moussa K.Traore，Gisela Buschle Z Diller.Environmally Friendly Seouring Proeesses［J］.TEXTILECHEMISTANDCOLORIST＆ AMERICAN DYESTUFFREPORT，2000，32（12）：40－43.

［4］ 姜錫瑞，段鋼.新編酶制劑實(shí)用技術(shù)手冊(cè)［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2002.

［5］ 郭勇 酶工程［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2004.

［6］ 石艷燕 多酶清潔劑與數(shù)控超聲波在清洗口腔小器械中的應(yīng)用［J］.華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（19）：4173.

［7］ 肖懷秋等 雙酶協(xié)同作用對(duì)大豆分離蛋白酶解的影響［J］.中國(guó)釀造，2008，（11）：28－29.