張瑞華，孫會芳，王 蕾

(1. 天津科技大學理學院，天津 300457；2. 天津科技大學海洋科學與工程學院，天津 300457)

鉻污染是土壤重金屬污染的重點之一，許多土壤修復方法和手段大多針對毒性及遷移性較大的鉻(Ⅵ)污染，如不能將其從土壤中徹底去除，則將鉻(Ⅵ)轉(zhuǎn)化為遷移性和可利用性較小的鉻(Ⅲ)[1–3]，但對修復后土壤的生態(tài)功能和生態(tài)風險評價卻關(guān)注較少．如何有效指示和監(jiān)測重金屬帶來的土壤污染，及評價修復后土壤的生態(tài)功能，應該是研究土壤污染控制與治理的前提[4–8]．土壤酶積極參與陸地生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)及能量轉(zhuǎn)化，與土壤生物、土壤理化性質(zhì)和環(huán)境條件密切相關(guān)，常用土壤過氧化氫酶、磷酸酶、蔗糖酶、脲酶、蛋白酶和多酚氧化酶活性之間的關(guān)系來評價土壤的肥力．重金屬離子對土壤酶活性產(chǎn)生的抑制或激活作用，影響土壤養(yǎng)分釋放及從土壤中獲取養(yǎng)分的作物生長，因此土壤酶活性的測定將有助于判斷土壤重金屬污染程度及其對作物生長的影響，其對重金屬的敏感性可作為土壤重金屬污染的生物指標[9]．有許多研究者[10–14]提出以土壤酶活性來判別土壤重金屬污染狀況．

在目前的有關(guān)重金屬對土壤酶影響的研究報道中，過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶通常作為重點研究檢測對象．如有人建議用過氧化氫酶作為鎘污染水平的指標[10]，脲酶活性可作為汞污染的生化監(jiān)測指標[10]，磷酸酶活性對鋅污染極為敏感[11]．不同重金屬對土壤酶的影響也有不同，關(guān)注較多的重金屬有鎘、汞、銅、鋅，對鉻的研究多針對鉻(Ⅵ)．如閆峰等[12]的研究表明鉻(Ⅵ)對過氧化氫酶有激活作用，對磷酸酶和脲酶起抑制作用，黃錚等[13]的研究表明銅對稻田土壤的過氧化氫酶、磷酸酶、脲酶均起抑制作用，楊春璐等[14]的研究表明，汞對脲酶有顯著的抑制作用，而中性磷酸酶的活性對汞不敏感．因此，本文旨在研究受關(guān)注較少的鉻(Ⅲ)對 3種土壤酶——脲酶、磷酸酶、過氧化氫酶活性的影響，為鉻污染土壤的質(zhì)量評價、生物治理及環(huán)境修復指標提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集及前處理

土壤取自天津科技大學泰達校區(qū)花園黃壤土，去除雜草及碎屑，過 2,mm 篩，風干并測定其理化性質(zhì)后，進行后續(xù)實驗操作．

1.2 實驗設計

實驗在培養(yǎng)箱中進行，土壤用孔徑為 0.1,mm 的篩子篩分，用三氯化鉻染毒，使土壤鉻(Ⅲ)染毒水平(不計背景值)分別為 0.2、1、5,g/kg 3種情況，取每種染毒水平土壤 30,g裝入錐形瓶中，加入 90,g蒸餾水，并稱出總質(zhì)量，放入培養(yǎng)箱中，在 25,℃下分別培養(yǎng) 1、5、10、15、20,d．在培養(yǎng)階段，不斷補充蒸餾水與原來的質(zhì)量一致．染毒土壤從培養(yǎng)箱中取出后，濾掉溶液，分析土壤酶活性，每個樣品進行 3個平行實驗．同時以空白土壤作對比．

1.3 分析方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)及鉻含量測定

土壤 pH、有機質(zhì)、含水率均采用國家標準分析方法；土壤總鉻含量采用高錳酸鉀氧化法、二苯基碳酰二肼顯色分光光度法測定．

1.3.2 土壤酶活性測定方法

采用文獻[15]中的測定方法進行酶活性測定：脲酶采用苯酚鈉、次氯酸鈉比色法；過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法；堿性磷酸酶采用苯酚、安替比林比色法．

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS17.0兩種軟件進行處理．

2 結(jié)果與討論

2.1 未染毒土壤理化性質(zhì)

所采土壤的理化性質(zhì)見表 1，其中有機質(zhì)含量2.7%，pH 7.27，略顯堿性．總鉻背景值為 650,mg/kg，鉻(Ⅵ)未檢出，即土壤背景值中的鉻為三價態(tài)形式存在．實驗用土壤鉻含量高于國家三級土壤標準(400,mg/kg)，可能與校園建在鹽堿地上，校園綠化用土均為異地(或有輕微污染)轉(zhuǎn)移而來有關(guān)．

表1 供試土壤性質(zhì)Tab.1 Properties of tested soil

2.2 脲酶活性變化

現(xiàn)有的文獻報道中，脲酶的活性在重金屬存在下，大多受到抑制．如 Yang等[16]的報道表明，Zn、Cd、Pb無論是單獨存在還是復合存在，均不同程度地抑制了脲酶的活性．本實驗的鉻污染土壤脲酶活性變化如圖 1所示．鉻(Ⅲ)存在下，不同染毒水平土壤脲酶活性整體隨時間延長呈降低的趨勢．前 10,d脲酶活性快速下降，之后活性變化趨勢減緩，并趨于穩(wěn)定．在實驗的 20,d內(nèi)，不同染毒水平土壤脲酶活性，除第1天0.2,g/kg、第20天5,g/kg的染毒土脲酶活性小于未染毒土活性外，其他染毒土壤脲酶活性均大于未染毒土的脲酶活性，與現(xiàn)有的文獻報道不盡相同．染毒水平為 1,g/kg的染毒土脲酶活性總體一直高于其他土壤的活性，染毒水平5,g/kg的染毒土脲酶活性略小于1,g/kg的培養(yǎng)土，但10,d后差距拉大，到20,d時已低于未染毒土．染毒水平為0.2,g/kg的染毒土脲酶活性下降速率最慢，說明這個染毒水平對脲酶活性影響較?。慈径就恋拿富钚栽谇?5,d降低，之后趨于穩(wěn)定，可能是未染毒土背景值中鉻(Ⅲ)對脲酶起一定的抑制作用．

圖1 Cr(Ⅲ)存在下土壤脲酶活性變化Fig.1 Changes of soil urease activity in the presence of Cr(Ⅲ)

2.3 堿性磷酸酶活性變化

Huang等[17]的研究表明，堿性磷酸酶活性與土壤中總鉻的含量呈正相關(guān)，而鉻(Ⅵ)對堿性磷酸酶的活性略有抑制作用，但未對鉻含量與堿性磷酸酶活性的動態(tài)變化作相關(guān)研究．鉻(Ⅲ)存在下堿性磷酸酶的活性變化如圖2所示．

圖2 Cr(Ⅲ)存在下土壤堿性磷酸酶活性變化Fig.2 Changes of soil alkaline phosphatase activity in the presence of Cr(Ⅲ)

1,d時染毒土壤堿性磷酸酶活性均低于未染毒土壤的酶活性，且隨著土壤染毒水平的提高而降低，表明鉻(Ⅲ)的存在抑制了堿性磷酸酶的活性，抑制程度與鉻(Ⅲ)的染毒水平成正比．隨著時間的延長，堿性磷酸酶活性逐漸升高，0.2,g/kg的染毒土的堿性磷酸酶活性與未染毒土的酶活性的變化趨勢一致，這可能是由于染毒水平較低，接近土壤背景值(650,mg/kg)的原因，但抑制作用已明顯體現(xiàn)出來．1,g/kg的染毒土的堿性磷酸酶活性盡管在第1天下降很大，但隨后快速上升，5,d時上升為最高值，隨后變化趨勢與未染毒土的趨勢相同，到 15,d后變化趨勢幾乎與未染毒土重合．5,g/kg的染毒土的堿性磷酸酶活性在第 5天時活性最低，隨后活性一直呈上升趨勢，15,d后趨于穩(wěn)定，到20,d時與未染毒土活性接近．這些變化趨勢表明盡管鉻(Ⅲ)的存在對堿性磷酸酶活性有抑制或激活作用，但同時堿性磷酸酶對鉻(Ⅲ)也有一定的耐受能力．

目前關(guān)于重金屬對酶活性的抑制機理普遍的看法有兩個，一個是重金屬與酶的活性點位存在與底物的競爭性抑制，另一個是重金屬的存在抑制了土壤微生物的生長和繁殖，從而降低了微生物體內(nèi)酶的合成與分泌，使土壤酶活性下降．而有學者也發(fā)現(xiàn)“抗性酶活性”現(xiàn)象，即當重金屬濃度達到一定，土壤中大量微生物死亡時，有一小部分微生物生存下來，產(chǎn)生抗性酶活性，表觀上酶活性值降低又增大．土壤堿性磷酸酶活性的變化或許正是這些作用的結(jié)果．

2.4 過氧化氫酶活性變化

重金屬對過氧化氫酶的影響報道不盡一致．如Belyaeva等[18]的研究表明過氧化氫酶活性受重金屬的影響較小，而 Khan等[19]的研究報道則為過氧化氫酶活性在 Cd、Pb存在下略受抑制，抑制程度與 Cd、Pb的濃度成正比．本實驗中鉻(Ⅲ)存在下過氧化氫酶的活性變化如圖3所示．

圖3 Cr(Ⅲ)存在下土壤過氧化氫酶活性變化Fig.3 Changes of soil catalase activity in the presence of Cr(Ⅲ)

本研究的結(jié)果表明在鉻(Ⅲ)存在下，土壤過氧化氫酶的活性均受到抑制，抑制程度隨土壤染毒水平的升高而增大．除 5,g/kg的染毒土外，其余染毒土壤的過氧化氫酶活性變化趨勢與未染毒土過氧化氫酶活性變化趨勢一致，為先下降后升高最后趨于穩(wěn)定的趨勢，而5,g/kg的染毒土過氧化氫酶活性一直為下降趨勢，15,d后盡管有所升高，但仍遠低于其他染毒水平及未染毒土壤．這表明盡管過氧化氫酶對鉻也有一定的耐受性，但耐受能力均不如脲酶和堿性磷酸酶，對外源鉻的加入更敏感．通過對過氧化氫酶相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，除第 1天、第 5天外，第 10、15、20天過氧化氫酶活性與土壤染毒水平呈顯著的負相關(guān)，其相關(guān)方程分別為：E＝335.4－17.5,x(r＝－0.952，P＜0.05)，E＝343.4－22.0,x(r＝－0.997，P＜0.01)，E＝343.5－19.5,x(r＝－0.972，P＜0.05)(式中：E 為過氧化氫酶活性，μg/(min·g)；x為土壤染毒水平，g/kg)．由此得出其酶活性生態(tài)劑量 ED50值分別為9.6、7.8、8.8,g/kg．因此可以考慮將過氧化氫酶活性作為鉻(Ⅲ)污染水平的生物監(jiān)測指標．

2.5 鉻(Ⅲ)對土壤酶活性影響對比

為定量描述鉻(Ⅲ)對土壤酶活性的影響，采用酶活性抑制率(定濃抑制率)予以表征，定濃抑制率＝(1-處理樣品的酶活性/對照樣品的酶活性)×100%，結(jié)果見表 2．可以看出，在 3個染毒水平土壤中，除0.2,g/kg染毒水平(第1天)、5,g/kg染毒水平(第15、20天)外，鉻(Ⅲ)對脲酶活性主要起激活作用，相同染毒水平第 5天激活程度最大．磷酸酶活性在 3個染毒水平下，除第 1天被抑制，且抑制程度與染毒濃度的增高而加大外，其余染毒時間呈現(xiàn)不規(guī)律的激活或抑制作用．過氧化氫酶在 3個染毒水平下均被抑制，抑制程度與染毒水平成正比．

表2 Cr(Ⅲ)對土壤酶活性的抑制率Tab.2 Inhibition effects of Cr(Ⅲ)on the actilities of soil enzymes

3 結(jié) 論

(1)鉻(Ⅲ)的存在，對土壤酶活性均產(chǎn)生一定的影響，影響程度隨染毒濃度、染毒時間、土壤酶種類的不同而不同．

(2)對土壤脲酶而言，低濃度鉻的存在起激活作用，高濃度則起抑制作用，無論激活還是抑制作用，隨染毒時間的變化趨勢不明顯；對土壤磷酸酶而言，隨不同染毒水平或培養(yǎng)時間表現(xiàn)為激活或抑制作用．因此上述兩種酶可能不適合作為土壤鉻污染的檢測指標．

(3)土壤過氧化氫酶活性對鉻的存在較為敏感，在實驗中的 3個染毒水平下其活性均被抑制，抑制程度與染毒水平成正比，可作為土壤鉻污染的檢測指標．

［1］ 王新新，張穎，王元芬. 底泥鉻污染的納米鐵粉修復及其土壤酶活性動態(tài)[J]. 生態(tài)環(huán)境，2008，17(6)：2207–2211.

［2］ 林立金，朱雪梅，邵繼榮，等. 鋅鉻復合污染對水稻不同生育期土壤酶活性的影響[J]. 核農(nóng)學報，2007，21(6)：623–629.

［3］ Wyszkowska J. Soil contamination by chromium and its enzymatic activity and yielding[J]. Polish Journal of Environmental Studies，2002，11(1)：79–84.

［4］ 和文祥，陳會明，馮貴穎，等. 汞鉻砷元素污染土壤的酶監(jiān)測研究[J]. 環(huán)境科學學報，2000，20(3)：338–343.

［5］ Renella G，Ortigoza A L R，Landi L，et al. Additive effects of copper and zinc on cadmium toxicity on phosphatase activities and ATP content of soil as estimated by the ecological dose(ED50)[J]. Soil Biology & Biochemistry，2003，35(9)：1203–1210.

［6］ Samborska A，Stepniewska Z，Stepniewski W. Influence of different oxidation states of chromium(VI，Ⅲ)on soil urease activity[J]. Geoderma，2004，122(2/3/4)：317–322.

［7］ K?z?lkaya R，A?k?n T，Bayrakl? B，et al. Microbiological characteristics of soils contaminated with heavy metals[J]. European Journal of Soil Biology，2004，40(2)：95–102.

［8］ Hinojosa M B，Carreira J A，García-Ruíz R，et al. Soil moisture pre-treatment effects on enzyme activities as indicators of heavy metal-contaminated and reclaimed soils[J]. Soil Biology and Biochemistry，2004，36(10)：1559–1568.

［9］ Alkorta I，Aizpurua A，Riga P，et a1. Soil enzyme activities as biological indicators of soil health [J]. Reviews on Environmental Health，2003，l 8(1)：65–73.

［10］ 盧顯芝，金建華，郝建朝，等. 不同土層土壤酶活性對重金屬汞和鎘脅迫的響應[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2009，28(9)：1844–1848.

［11］ 黃永杰，楊紅飛，張棟，等. 鋅脅迫對水花生生長和土壤酶活性的影響[J]. 上海交通大學學報：農(nóng)業(yè)科學版，2009，27(4)：403–408.

［12］ 閆峰，吳雄平，梁東麗，等. 外源重金屬 Cr、Cu、Se 和Zn對土婁土酶活性的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2008，36(7)：91–98.

［13］ 黃崢，閔航，呂鎮(zhèn)梅，等. 銅離子與銅鎘離子復合污染對稻田土壤酶活性的影響研究[J]. 浙江大學學報：農(nóng)業(yè)與生命科學版，2006，32(5)：557–562.

［14］ 楊春璐，孫鐵珩，和文祥，等. 汞對土壤酶活性的影響[J]. 應用生態(tài)學報，2007，18(3)：620–624.

［15］ 關(guān)松蔭. 土壤酶及其研究方法[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1986：274–340.

［16］ Yang Zhixin，Liu Shuqing，Zheng Dawei，et al. Effects of cadium，zinc and lead on soil enzyme activities[J]. Journal of Environmental Sciences，2006，18(6)：1135–1141.

［17］ Huang Shunhong，Peng Bing，Yang Zhihui，et al. Chromium accumulation，microorganism population and enzyme activities in soils around chromium-containing slag heap of steel alloy factory [J]. Transactions of Nonferrous Metals Society of China，2009，19(1)：241–248.

［18］ Belyaeva O N，Haynes R J，Birukova O A. Barley yield and soil microbial and enzyme activities as affected by contamination of two soils with lead，zinc or copper [J].Biology and Fertility of Soils，2005，41(2)：85–94.

［19］ Khan S，Cao Q，Hesham A E L，et al. Soil enzymatic activities and microbial community structure with different application rates of Cd and Pb [J]. Journal of Environmental Sciences，2007，19(7)：834–840.