曹春暉，孫世春，麥康森，梁 英

(1. 中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，青島 266003；2. 天津科技大學天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津 300457)

微藻具有生化合成高度不飽和脂肪酸(highly unsaturated fatty acids，HUFAs)的能力，因此被作為二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等(n-3)HUFAs的新來源而受到廣泛重視．微藻可作為浮游動物(輪蟲、枝角類等)、甲殼類、雙殼類和幼齡魚類的餌料而在海水養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位．對許多海產(chǎn)動物來說，餌料中含有豐富的魚蝦類生長所必需的脂肪酸(essential fatty acids，EFA)尤其是 EPA 和DHA，能夠提高其生長率和幼體的存活率．HUFAs對人體也有非常重要的生理作用，可防治多種心血管疾病，促進兒童智力及心理發(fā)育．

微藻的脂肪含量以及脂肪酸構(gòu)成的數(shù)量和質(zhì)量都可因環(huán)境因子而改變[1–2]．微藻在不同生長時期脂肪酸組成和含量差別很大，(n-3)HUFAs的產(chǎn)量可因在藻類生長的特殊時期進行收獲而達到最大值．關(guān)于生長時期對微藻脂肪含量和脂肪酸組成的影響已有多個報道[3–10]，但國內(nèi)外對裂絲藻的研究則未見報道．本文對 1株裂絲藻和 3株小球藻共 4株綠藻在不同生長時期培養(yǎng)時其脂肪含量和脂肪酸組成進行了測定，以期找出其生長和脂肪酸合成的最適條件，為微藻的不飽和脂肪酸研究提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 藻種

實驗所用微藻藻種取自中國海洋大學微藻種質(zhì)庫(MACC)：小球藻 Chlorella spp. MACC/C95、MACC/C97、MACC/C102和桿狀裂絲藻Stichococcus bacillaris MACC/C19．

1.2 培養(yǎng)條件

對 4株藻種作不同生長時期(指數(shù)期、穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期)的培養(yǎng)實驗．其中海水經(jīng)沉淀后用脫脂棉過濾，煮沸消毒．采用f/2培養(yǎng)基．實驗于2,L細口瓶中進行，連續(xù)充氣，連續(xù)光照(4,500,lx)，培養(yǎng)液鹽度為 28‰，室溫(20±1)℃．每天用血球計數(shù)板法計數(shù)細胞濃度．

1.3 微藻收獲

微藻在指數(shù)生長末期至穩(wěn)定前期 4,000,r/min離心收獲，真空干燥．

1.4 脂肪測定

采用索氏抽提法．

1.5 脂肪酸分析

樣品處理及氣相色譜分析按文獻[11]方法進行.取 40,mg樣品于離心管中，加入體積比為 2∶1的氯仿和甲醇溶液 10,mL，振蕩后加入 2,mol/L的NaOH/CH3OH 溶液 1,mL，充分振蕩，75,℃水浴加熱15,min進行皂化，冷卻后加入 2,mol/L 的HCl/CH3OH 溶液，調(diào)節(jié) pH≤2，在 75,℃水浴中加熱15,min，使其甲酯化，然后加入 1,mL的正己烷振蕩，取上清液進行色譜分析．

氣相色譜分析采用美國 HP5890Ⅱ型氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器，Coawax carbowax毛細管柱(30,m×0.25,mm)，進樣口和檢測器溫度均為280,℃，程序升溫，載氣為高純氮，流量2,mL/min，進樣量1,μL．以面積歸一法得到各脂肪酸組分的相對含量．各個脂肪酸的鑒定通過比較實驗樣品色譜圖與標準樣品色譜圖以及各脂肪酸的出峰時間來進行．

1.6 數(shù)據(jù)處理

標準差及單因子方差分析由 Excel軟件處理分析，結(jié)果用平均值±標準差表示．

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪含量

不同生長時期對 4株綠藻的脂肪含量的影響見表 1．結(jié)果表明，生長時期對 4株綠藻的脂肪含量影響顯著(P＜0.05)．從表 1可以看出：C19、C95和C97的脂肪含量隨生長時期的延長呈增加趨勢．C19的脂肪含量在穩(wěn)定后期達到最大值(33.7%)；C95和C97的脂肪含量在指數(shù)期和穩(wěn)定前期之間隨生長時期的延長顯著增加，而在穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期之間增長緩慢(分別為 16.6%～19.2%和 27.7%～32.1%)；C102的脂肪含量在指數(shù)期和穩(wěn)定前期之間呈增加趨勢，并在穩(wěn)定前期獲得脂肪含量的最大值(28.1%)，之后則隨生長時期的延長有所下降．

2.2 脂肪酸組成

不同生長時期(指數(shù)期、穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期)對4株綠藻脂肪酸組成的影響見表 2．結(jié)果表明：16∶0(19.5%～39.8%)，16∶1(n-7)(21.9%～32.9%)，18∶1(n-9)(3.1%～14.7%)，20∶4(n-6)(1.9%～4.8%)和EPA(6.7%～28.4%)是 4株綠藻的主要脂肪酸成分，生長時期對 4株綠藻的主要脂肪酸成分含量影響顯著(P＜0.05)．

表2 不同生長時期4株綠藻的主要脂肪酸組成Tab.2 Fatty acid compositions in the four strains of green algae at different growing phases %

由表2可以看出：4株綠藻的脂肪酸組成和含量隨生長時期變化較大．裂絲藻 C19和 3株小球藻C95、C97和 C102中的 EPA含量均在指數(shù)期最高，分別可達17.3%、28.1%、28.4%和14.8%．C19的20∶4(n-6)含量在各生長時期保持穩(wěn)定，16∶1(n-7)在穩(wěn)定前期含量最低，而在指數(shù)期和穩(wěn)定后期含量較大．16∶0含量隨生長時期而增加，14∶0則在各生長時期變化不明顯．

小球藻 C95的 20∶4(n-6)、18∶3(n-3)和 16∶1(n-7)含量隨生長時期的延長而減少，而 18∶1(n-9)、16∶0、14∶0含量則隨生長時期的延長而增加，在指數(shù)期和穩(wěn)定前期有極低的 DHA含量．C97的14∶0和 16∶1(n-7)含量在各生長時期基本穩(wěn)定，16∶0和 18∶1(n-9)含量在指數(shù)期和穩(wěn)定前期較為穩(wěn)定，而在穩(wěn)定后期有顯著增加．18∶3(n-3)含量在穩(wěn)定前期含量較低，而在指數(shù)期和穩(wěn)定后期較高．20∶4(n-6)含量在指數(shù)期和穩(wěn)定前期較為穩(wěn)定，而在穩(wěn)定后期明顯降低．18∶1(n-7)在穩(wěn)定前期有較多含量(4.0%)，而在穩(wěn)定后期降為 0.1%，指數(shù)期未檢出．C102的 20∶4(n-6)含量在指數(shù)期較高，在穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期含量降低．18∶3(n-3)含量在穩(wěn)定前期最低，而在指數(shù)期和穩(wěn)定后期都會增加．16∶1(n-7)含量在各生長時期保持穩(wěn)定，16∶0含量隨生長時期的延長而增加，14∶0含量則隨生長時期的延長而降低．

C19的單不飽和脂肪酸(MUFA)總量在各生長時期變化不大，飽和脂肪酸(SFA)總量則隨生長時期的延長略有增加，HUFAs含量在指數(shù)期較高，而在穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期含量降低但較為穩(wěn)定．C95和C97的SFA總量隨收獲期的延長而有顯著增加，C102的SFA含量隨生長時期呈升高趨勢．C95的MUFA總量在各生長時期保持穩(wěn)定，C97的 MUFA在指數(shù)期和穩(wěn)定前期保持穩(wěn)定，而到穩(wěn)定后期有顯著升高，C102的MUFA在指數(shù)期含量較低，而在穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期有明顯升高且保持穩(wěn)定．3株小球藻 C95、C97、C102的多不飽和脂肪酸含量HUFAs總量隨收獲時期的延長而有明顯的降低．

3 討 論

在本實驗結(jié)果中，4株綠藻的主要脂肪酸組成為14∶0、16∶0、16∶1(n-7)、18∶1(n-9)、18∶3(n-3)、20∶4(n-6)和 EPA，DHA含量很少或不含，符合綠藻綱的脂肪酸特征[11–12]．4株綠藻的脂肪含量均隨生長時期的延長而增加，表明脂肪在穩(wěn)定期積累．有報道[13–14]認為細胞進入穩(wěn)定期后，培養(yǎng)基中氨基酸合成所必需的氮減少了，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成量降低，光合作用所同化的碳進入到碳水化合物和脂肪中，出現(xiàn)能量積累的趨勢．Mansour等[9]的實驗結(jié)果表明，Gymnodinium sp.的脂肪含量在穩(wěn)定期(第 43天)比指數(shù)期(第 6天)時提高了 30倍．魏東等[15]對Ellipsoidion sp.和 Nannochloropsis oculata 的研究結(jié)果也表現(xiàn)出了相同的規(guī)律．

研究結(jié)果顯示指數(shù)期 HUFAs含量較高，這是由于指數(shù)期藻細胞生長旺盛，光合效率高，類囊體數(shù)量及表面積增加，極性甘油脂(含有較多的HUFA)作為類囊體膜的主要組分，其含量相應升高[16]．Piorreck等[17]通過對小球藻Chlorella vulgaris的研究指出，綠藻的脂肪酸組成及含量隨生長時期而改變，在生長起始階段綠藻能產(chǎn)生大量的極性脂肪和16碳、18碳多不飽和脂肪酸，而生長后期，綠藻的主要脂肪變?yōu)橹行郧襇UFA和SFA的含量大增．Liang等[5–6]報道了Chaetoceros gracilis(MACC/B13)、Cylindrotheca fusiformis(MACC/B211)、Phaeodactylum tricornutum(MACC/B221)和 Nitzschia closterium (MACC/B222)的HUFAs和EPA含量在指數(shù)期最高，隨生長時期的延長其含量減少；4株筒柱藻 Cylindrotheca(B156、B164、B196、B200)的 HUFAs均在指數(shù)期或穩(wěn)定前期達到高峰．Fidalgo等[7]的研究結(jié)果表明 Isochrysis galbana的 HUFAs含量在穩(wěn)定前期達到最大值，隨后在穩(wěn)定期逐漸降低．Lin等[8]的結(jié)果表明I.,galbana CCMP 1324的SFA、MUFA以及HUFA含量均在穩(wěn)定前期達到最大值．李文權(quán)等[10]的結(jié)果表明I.,galbana、Dunaliella salina 和 Chlorella sp.的總多不飽和脂肪酸(THUFA)含量在指數(shù)期明顯高于穩(wěn)定期，其中 D.,salina 的 18∶3(n-3)、Chlorella sp.的EPA和I.,galbana的DHA含量均在指數(shù)期達到最大值．本實驗結(jié)果顯示，4株綠藻的EPA和HUFAs含量均隨生長時期的延長而下降，C19、C95和C102中的 EPA含量在指數(shù)期達到最大值，C97在指數(shù)期和穩(wěn)定前期 EPA 含量較高，穩(wěn)定后期顯著降低；C19、C95、C97和C102的HUFAs含量均在指數(shù)期達到最大值，與上述結(jié)果一致．

生長時期對微藻脂肪酸的影響因種而異．三酰甘油含量高的藻類中含有相對高比例的飽和脂肪酸及單烯酸，而 HUFA 較少[4,18–20]．Fernández-Reiriz等[3]報道了生長時期對微藻的 EPA和 DHA影響因種而異．Mansour等[9]的結(jié)果表明 Gymnodinium sp.的18∶5(n-3)和 EPA 隨培養(yǎng)時間而減少，而 DHA 含量隨培養(yǎng)時間增加．Dustan等[4]報道了 N.,oculata在指數(shù)期 HUFAs相對含量最高，Pavlova lutheri在穩(wěn)定前期 HUFAs相對含量最高，而 Isochrysis sp.的HUFAs含量隨生長時期變化不明顯．Hopley等[21]也報道了C.,vulgaris(CCAP211/8,K)和(CCAP211/11C)的脂肪酸組成在指數(shù)期和穩(wěn)定期沒有明顯的變化．

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