劉淑宇 于新等

摘 要： 【目的】為了探索綠色木霉菌（Trichoderma viride）發(fā)酵液對杧果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）胞內(nèi)抗性酶活性的影響，【方法】以C. gloeosporioides為供試菌，加入T. viride發(fā)酵液，終濃度為MIC50值（1.0% v/v），測定0.0～30.0 h內(nèi)C. gloeosporioides胞內(nèi)CAT、POD、PPO、SOD、PAL和脫氫酶活力?！窘Y(jié)果】T. viride發(fā)酵液抑制胞內(nèi)抗性酶活性，致使細(xì)胞膜保護系統(tǒng)損壞，胞內(nèi)物質(zhì)大量外泄，最終抑制或殺死病菌。經(jīng)T. viride發(fā)酵液處理的C. gloeosporioides，30 h后，胞內(nèi)CAT、POD、PPO、PAL和脫氫酶活力分別比對照組低52.54%、23.62%、58%、6.38%、6.52%、44.74%?！窘Y(jié)論】T. viride發(fā)酵液可顯著降低C. gloeosporioides胞內(nèi)抗性酶活力，抑制C. gloeosporioides生長。

關(guān)鍵詞： 綠色木霉菌； 發(fā)酵液； 杧果炭疽菌； 抗性酶活

中圖分類號：S667.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪02-0285-06

杧果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz）是杧果等多種熱帶、亞熱帶水果采前及采后的主要病原真菌之一，具潛伏侵染性，可引起貯藏期間的杧果30%～50%腐爛。中國、美國、印度、巴西、菲律賓、泰國、印度尼西亞、剛果等國均有報道。人們已經(jīng)研究了肉桂[1]、石菖蒲[2]、香根草[3]等植物提取物對炭疽菌菌絲生長、孢子萌發(fā)的抑制作用[4]，以及溫度、濕度[5]、光照[6]等因素對孢子萌發(fā)的影響，但植物提取物成本高，原材料受生長季節(jié)和地域的限制，難以在杧果采后保鮮處理的生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。利用拮抗微生物定向發(fā)酵技術(shù)，生產(chǎn)抑菌防腐物質(zhì)的發(fā)酵條件和工藝皆可控制，為實現(xiàn)低成本果蔬采后生物保鮮劑的連續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能。

木霉菌（Trichoderma）是一類自然界普遍存在的真菌。其中，綠色木霉菌（Trichoderma viride）、哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）、康氏木霉菌（Trichoderma koningii）、鉤狀木霉菌（Trichoderma hamatum）和長枝木霉菌（Trichoderma longibrachiatum）等對農(nóng)作物田間真菌病害具拮抗作用[7-9]。T. viride具有適應(yīng)性強，繁殖速度快、對植物病原真菌具廣譜拮抗作用等優(yōu)點，已成為人們研究的熱點[10-11]。國內(nèi)外對T. viride防治農(nóng)作物田間病害的拮抗作用機理，以及應(yīng)用進(jìn)行了研究[12-14]，前人從3個方面對T. viride發(fā)酵液進(jìn)行研究： 即T. viride發(fā)酵液發(fā)酵條件的優(yōu)化、抑菌活性及穩(wěn)定性[15-17]； T. viride發(fā)酵液對抑菌機理的研究[18-19]； T. viride發(fā)酵液對杧果采后保鮮的研究[20-21]。但至今尚未見T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)抗性酶活力影響的報導(dǎo)。我們探索T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)CAT、POD、PPO、SOD、PAL等抗性酶活力的影響，以期探求其抑制C. gloeosporioides的生化作用機制，為T. viride發(fā)酵液在杧果采后保鮮上的應(yīng)用提供理論研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

綠色木霉菌 （T. viride），購于廣東省微生物研究所；杧果炭疽菌（C. gloeosporioides Penz），華南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 T. viride發(fā)酵液的制備 參照蔣雨[15]的方法，培養(yǎng)基配方：200.0 g馬鈴薯，10.0 g玉米粉，20.0 g葡萄糖，1.0 g吐溫-80，1.0 L水。T. viride經(jīng)活化培養(yǎng)，制成106 CFU·mL-1孢子懸液，250 mL錐形瓶中加50 mL培養(yǎng)基，接種量1.0%（v/v），于32.5 ℃，125 r·min-1，培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液經(jīng)孔徑0.22 μm濾膜過濾，除去孢子，50 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1/25體積，得樣液，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 C. gloeosporioides菌種培養(yǎng) 參照Latoud等[22] 的方法，將C. gloeosporioides接種于PDA培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d，刮孢子于PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 125 r·min-1培養(yǎng)72 h。

1.2.3 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)過氧化氫酶活性的影響 參照前人[18，23-24]方法，培養(yǎng)好的C. gloeosporioides經(jīng) 4 000 r·min-1，離心10 min，收集幼嫩菌絲體。重懸浮于PBS緩沖液中，加T. viride發(fā)酵液樣液，使終濃度達(dá)MIC50值[15，18]。以等體積無菌水為對照。分別于0.0、6.0、12.0、18.0、24.0、30.0 h取樣，超聲破碎8 min，于4 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液。取含0.01 g·L-1 H2O2的磷酸鹽緩沖液 （0.1 mol·L-1 pH7.0） 2.0 mL置30 ℃下保溫30 min，加1.0 mL酶液，于240 nm（DU730紫外及可見分光光度計，美國Beckman coulter Inc）處測吸光值。

1.2.4 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)過氧化物酶活性的影響 參照汪金蓮等[25]方法，培養(yǎng)好的C. gloeosporioides經(jīng) 4 000 r·min-1，離心10 min，收集幼嫩菌絲體。重懸浮于PBS緩沖液中，加T. viride發(fā)酵液樣液，使終濃度達(dá)MIC50值[15，18]。以等體積無菌水為對照組。分別于0.0 h、6.0 h、12.0 h、18.0 h、24.0 h、30.0 h取樣，超聲破碎8 min，4 000 r·min-1離心10 min，上清液為粗酶液。取1mL上清液，加1 mL 0.05 mol·L-1 H2O2，，2 mL 40 g·L-1愈創(chuàng)木酚，25 ℃反應(yīng)5 min，470 nm處測吸光度。

1.2.5 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)多酚氧化酶活性的影響 參照黃卓烈等[26]方法，粗酶提取方法同1.2.4，以1 mL 0.1 mol·L-1鄰苯二酚為底物，加入2 mL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液（pH 7.0），1 mL酶液，30 ℃保溫10 min，加1 mL 20 mg·mL-1 H2O2，525 nm處測吸光度。

1.2.6 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)超氧化物歧化酶活性的影響 參照嚴(yán)萬里等[27]方法，培養(yǎng)好的C. gloeosporioides經(jīng) 4 000 r·min-1，離心10 min，收集幼嫩菌絲體。重懸浮于PBS緩沖液中，加T. viride發(fā)酵液樣液，使終濃度達(dá)MIC50值[15-17]。以等體積無菌水為對照組。0.0 h、6.0 h、12.0 h、18.0 h、24.0 h、30.0 h取樣，超聲破碎8 min，4 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，即為SOD粗提液。取4.5 mL緩沖液，4.2 mL蒸餾水加入試管中，25 ℃保溫25 min，加0.3 mL 0.1 mmol·L-1（以10 mmol·L-1 HCl配制）預(yù)熱的鄰苯三酚，迅速搖勻，于325 nm處測吸光度。

1.2.7 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)苯丙氨酸解氨酶活性的影響 參照王寶通等[28]方法，培養(yǎng)好的C. gloeosporioides經(jīng) 4 000 r·min-1，離心10 min，收集幼嫩菌絲體。重懸浮于0.2 mol·L-1、pH 8.8的硼酸緩沖液（含40 g·L-1 PVP，2 mmol·L-1 EDAT和5 mmol·L-1 β-琉基乙醇）中，加T. viride發(fā)酵液樣液，使終濃度達(dá)MIC50值[15-17]。對照組添加等體積無菌水。0.0 h、6.0 h、12.0 h、18.0 h、24.0 h、30.0 h取樣，超聲破碎8 min，4 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系中依次加入：1.6 mL 50 mmol·L-1、pH 8.8硼酸緩沖液、1 mL 30 mmol·L-1 L-苯丙氨酸，37 ℃保溫平衡5 min，加2.4 mL粗酶液。290 nm處測吸光值作為反應(yīng)的初始值，37 ℃保溫60 min。再次測定290 nm吸光值作為終止值。根據(jù)吸光度值變化，用酶促反應(yīng)產(chǎn)物trans-肉桂酸生成量表示PAL酶活性。

1.2.8 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)脫氫酶活性的影響 參照楊天佑等[29]方法，培養(yǎng)好的C. gloeosporioides經(jīng) 4 000 r·min-1離心10 min，收集幼嫩菌絲體。重懸浮于0.2 mol·L-1、pH 8.8的硼酸緩沖液（含40 g·L-1 PVP，2 mmol·L-1 EDAT和5 mmol·L-1 β-琉基乙醇）中，加T. viride發(fā)酵液樣液，使終濃度達(dá)MIC50值[15-17]。對照組添加等體積無菌水。0.0 h、6.0 h、12.0 h、18.0 h、24.0 h、30.0 h取樣，超聲破碎8 min，4 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系為：2 mL上清液，1.5 mL Tris-HCl緩沖液（1 mmol·L-1，pH 8.0），0.5 mL 3.6 g·L-1 Na2S2O4，2 mL 4 g·L-1 TTC，迅速將其放入37 ℃水浴振蕩器內(nèi)震蕩培養(yǎng)30 min，加1 mL甲醛終止反應(yīng)，3 000 r·min-1離心5 min，棄上清，向反應(yīng)體系中加3 mL丙酮萃取10 min，3 000 r·min-1離心5 min，于485 nm處測吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)過氧化氫酶活性的影響

在需氧生物體內(nèi)，過氧化氫酶（CAT）作為活性氧清除劑，可減免細(xì)胞在脅迫下所受到的損傷。試驗期間，C. gloeosporioides胞內(nèi)CAT活性整體呈上升趨勢，但發(fā)酵液處理組增幅遠(yuǎn)小于對照組。30 h后，對照組及發(fā)酵液處理組的C. gloeosporioides胞內(nèi)CAT活力分別為22.24、14.58 U·g-1。分別比初始值增加95.56%、39.29%，差異顯著（P<0.01）。

2.2 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)過氧化物酶活性的影響

過氧化物酶（POD）存在于需氧生物體內(nèi)，可抵御外界不良因素對生物體構(gòu)成損傷的功效試驗初期，菌體細(xì)胞中POD活性較低，6 h后POD活性增幅較大，培養(yǎng)30 h后，發(fā)酵液處理組POD活性比對照組降低23.62%。

2.3 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)多酚氧化酶活性的影響

多酚氧化酶（PPO）普遍存在于植物和微生物體內(nèi)。逆境下，PPO可將酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)為更具毒性的醌，且參與生物體內(nèi)多種生理生化反應(yīng)，以抵御或降低不利因素對生物體的損傷作用。由圖3可見，在試驗過程中，C. gloeosporioides胞內(nèi)PPO活性整體呈上升趨勢，且T. viride發(fā)酵液處理組PPO活性明顯低于對照組。30 h后，經(jīng)發(fā)酵液處理的杧果炭疽菌體內(nèi)PPO活性為0.74 U·g-1，比對照組低58%，差異顯著（P<0.01）。

2.4 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)超氧化物歧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）為生物體內(nèi)有效的超氧自由基清除劑，在細(xì)胞防御體系中起重要作用。在0～30 h試驗時間內(nèi)，C. gloeosporioides胞內(nèi)SOD活性整體呈下降趨勢，且發(fā)酵液處理組降幅大于對照組。培養(yǎng)30 h后，對照組、發(fā)酵液處理組C. gloeosporioides胞內(nèi)SOD活力分別比初始值降低25.44%，36.13%（P<0.01）。此時，處理組SOD活力低于對照組6.52%。

2.5 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)苯丙氨酸解氨酶活性的影響

苯丙氨酸解氨酶（PAL）參與細(xì)胞內(nèi)酚類物質(zhì)的合成，加速苯丙烷類物質(zhì)的代謝，抵御不良因素對生物體的侵害。圖5所示，試驗期間，C. gloeosporioides胞內(nèi)PAL活性整體呈上升趨勢，0～18 h時， PAL活性增幅較大，之后較為平緩，且整個試驗過程中，對照組增幅遠(yuǎn)大于發(fā)酵液處理組。30 h后，發(fā)酵液處理組苯丙氨酸解氨酶活力為9.41 U·g-1，比對照組低6.38%（P<0.01）。

2.6 T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)脫氫酶活性的影響

微生物活力指標(biāo)評定中，胞內(nèi)脫氫酶活力可被用于表征細(xì)胞呼吸強度及活力水平，其活力的升高與菌群數(shù)量的增長速率呈正相關(guān)。試驗期間，2組C. gloeosporioides胞內(nèi)脫氫酶活性整體呈上升趨勢，與對照組相比，試驗組脫氫酶由于受到T. viride發(fā)酵液的影響，活力遠(yuǎn)低于對照組。培養(yǎng)30 h，試驗組酶活力比對照組低44.74%。

3 討 論

研究T. viride發(fā)酵液對C. gloeosporioides胞內(nèi)抗性酶活力的抑制作用，探索T. viride代謝抗生物質(zhì)對病原菌抑制的作用機理。

CAT廣泛存在于動植物和微生物細(xì)胞膜上。逆境下，機體CAT活性增強。催化H2O2分解為氧和水，減輕活性氧所造成的損傷。試驗中，隨著T. viride發(fā)酵液處理時間的延長，C. gloeosporioides胞內(nèi)CAT酶的活力呈先上升后下降趨勢。30 h后，發(fā)酵液處理組CAT酶活力比對照組低34.42%。同汪金蓮等[25]在茶多酚對稻瘟病菌抑制效果的研究。可能是由于T. viride發(fā)酵液的作用， C. gloeosporioides的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性受損[18]，細(xì)胞膜的屏障以及酶系保護功能喪失，致使胞內(nèi)物質(zhì)大量外泄。

POD 酶存在于需氧生物體內(nèi)，屬細(xì)胞保護酶系統(tǒng)，可清除活性氧自由基，對于抵御多種理化因子脅迫、減少活性氧積累、維護膜結(jié)構(gòu)的完整性均有重要作用。多酚氧化酶（PPO）可將酚類物質(zhì)氧化產(chǎn)生具有更強抑菌力的醌類物質(zhì)；參與苯丙烷類衍生物代謝以及類黃酮和生物堿的合成等生理生化過程[26]。30 h培養(yǎng)，T. viride 發(fā)酵液處理組中，C. gloeosporioides胞內(nèi)POD、PPO酶活力均低于對照組?？赡苁怯捎赥. viride發(fā)酵液處理破壞菌體細(xì)胞膜系統(tǒng)、使得菌體酶蛋白更易受到內(nèi)外環(huán)境的影響，進(jìn)而誘使微生物的正常代謝紊亂。

SOD酶可清除細(xì)胞中多余的超氧陰離子，抵御氧自由基毒害[28]。試驗期間，對照組、發(fā)酵液處理組SOD酶活性分別下降25.44%，36.13%。生物體中，PAL為酚類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，可加速苯丙烷類物質(zhì)的代謝，在機體抗逆性反應(yīng)中起重要作用。整個試驗過程中，PAL活性呈整體下降趨勢，且發(fā)酵液處理組比對照組低6.38%。這可能與發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)作用的“孔道形成”有關(guān)。在一定的膜電位下，抑菌物質(zhì)吸附于C. gloeosporioides細(xì)胞膜上，其C末端侵入膜內(nèi)形成通透孔道，允許分子量小于0.5kDa的親水分子流入，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化及ATP的泄露，細(xì)胞外水分子流入，造成細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)迅速滲漏，細(xì)胞自溶而死亡[30-31]。

脫氫酶活性是衡量微生物呼吸生理代謝活力的重要指標(biāo)。TTC法測定脫氫酶活性是表征細(xì)胞代謝活力的一種有效方法[29，32]。研究發(fā)現(xiàn)T. viride發(fā)酵液處理使C. gloeosporioides細(xì)胞膜受損嚴(yán)重，膜透性增強。酶蛋白及核酸等物質(zhì)由胞內(nèi)大量泄漏出來，最終導(dǎo)致病原菌死亡[18]。本試驗中，發(fā)酵液處理組脫氫酶活性比對照組低44.74%，可能是由于發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)干擾了C. gloeosporioides呼吸代謝，進(jìn)而抑制其生長或?qū)е滤劳觥?/p>

4 結(jié) 論

C. gloeosporioides 是杧果果實采前及采后的主要病害之一，嚴(yán)重影響了杧果的產(chǎn)量和質(zhì)量。本試驗利用T. viride發(fā)酵液處理C. gloeosporioides，并分別選取0.0 h、6.0 h、12.0 h、18.0 h、24.0 h、30.0 h對C. gloeosporioides 胞內(nèi)CAT、POD、PPO、SOD、PAL和脫氫酶活性進(jìn)行測定。結(jié)果表明，T. viride發(fā)酵液可降低杧果炭疽菌CAT、POD、PPO、SOD、PAL和脫氫酶的活性，抑制C. gloeosporioides的生長。其作用機理可能為：發(fā)酵液處理誘使C. gloeosporioides細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性破壞，胞內(nèi)物質(zhì)外泄，最終導(dǎo)致菌體細(xì)胞凋亡。

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