郭東起，侯旭杰，*

（1.塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300；2.新疆特色農畜產品加工重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

冬棗是新疆環(huán)塔里木盆地近幾年種植的晚熟鮮食品種，以其豐富的營養(yǎng)，優(yōu)良的品質受到消費者的青睞，由于冬棗含水量高，皮薄肉脆，極易受機械損傷和微生物侵染而腐爛變質，故不耐貯運，冬棗貯藏期的侵染性病害主要有漿胞病、霉腐病、果柄基腐病等[1－2]，霉腐病病原菌以青霉菌、根霉為主，青霉菌引起的霉腐病稱青腐病，其癥狀是，受害冬棗為青綠色斑，圓形或不規(guī)則形狀，用手觸壓病斑表皮為濕潤狀。病部果肉組織為褐色或黑褐色，發(fā)病后期病部表面產生青綠色的霉層，病果軟腐或潰爛，對新疆冬棗采后貯藏品質危害嚴重。為此，在2010～2011年，對新疆冬棗在貯藏過程中引起腐爛的青霉菌進行了分離與純化，獲得1株典型致病菌，并對其進行鑒定，探討了其生物學特性，旨在為綜合防治冬棗采后貯藏中青腐病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

葡萄糖、蔗糖、乳糖、D-甘露醇、麥芽糖、NH4NO3、KNO3、（NH3）2SO4、NH3Cl、NaNO3等，以上試劑為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

蔡氏培養(yǎng)基：K2HPO41.00g，KCl0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂粉 20.00g，無菌蒸餾水 1000mL，自然pH。

PDA培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水1 000 mL煮沸30 min，紗布過濾，再加2%葡萄糖和2%瓊脂，121℃，滅菌15 min。

1.1.3 主要試驗儀器

LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-250C恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；DZKW-S-6電熱恒溫不銹鋼水浴鍋：鞏義英峪華儀器；101-5ARS電熱鼓風干燥箱：北京永光明醫(yī)療儀器廠；XB-K-25血球計數(shù)板：浙江省玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 病原菌鑒定

1.2.1.1 病原菌分離及其致病性鑒定[3-4]

冬棗2010年10月采于農一師十團，選擇成熟度一致（7～8成熟）、大小均一、無病蟲害及無機械損傷的果實，當天運回并貯藏在實驗室冷庫。2010年11月，選擇自然發(fā)病的具有青霉癥狀的冬棗，用75%酒精浸泡消毒10 min后，用無菌水清洗后，在病斑與健康組織交接處取5 mm 2小方塊，接種于PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)于28℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱。待菌絲長出，挑取于培養(yǎng)皿中劃線分離，然后在2%瓊脂水培養(yǎng)基中單孢純化。

選擇品質優(yōu)良的冬棗，用2%次氯酸鈉溶液浸泡消毒后，用無菌水清洗，自然晾干備用。無菌操作條件下，純化培養(yǎng)的病原菌接到PDA培養(yǎng)基上，28℃，培養(yǎng)7 d后，用接種環(huán)在培養(yǎng)好的霉菌試管斜面上刮取適量孢子，轉移到5 mL含0.05%Tween-80的無菌水中，并通過四層無菌紗布過濾，以濾去其菌絲體。用血球計數(shù)板計數(shù)，并添加含0.05%Tween-80的無菌水調整病原菌孢子數(shù)目為1×105spores/mL，然后用接種針蘸取孢子懸浮液在冬棗赤道部針刺接種，每個果實接種5針，接種深度基本一致，以刺破果實表皮為宜。28℃保濕培養(yǎng)（相對濕度85%～90%），每日觀察并記錄其發(fā)病癥狀。對接種成功的發(fā)病果實再進行組織分離純化，獲得致病菌。

1.2.1.2 病原菌的形態(tài)學分類鑒定

觀察感病果實外觀病害癥狀，采用的玻片培養(yǎng)法[5]將病原菌培養(yǎng)7 d后觀察其菌落形態(tài)及顯微形態(tài)，參照真菌形態(tài)學鑒定手冊的方法，鑒定分離所得致病菌的種類。

1.2.2 不同碳源、氮源對橘青霉生長的影響[6]

基礎培養(yǎng)基為蔡氏培養(yǎng)基，碳源試驗：以KNO3為氮源，分別加入不同碳源30.0 g，不加碳源的蔡氏培養(yǎng)基作為對照；氮源試驗：以蔗糖為碳源，分別加入不同氮源2.00 g，不加氮源的蔡氏培養(yǎng)基作為對照。

橘青霉在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d（28℃），以內徑為5 mm的打孔器打下菌苔，然后將其接種于不同碳源、氮源的PDA培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫恒濕培養(yǎng)，每處理重復3次，采用十字交叉法逐日測量菌落直徑。7 d后測量其產生飽子的量，同時觀察其培養(yǎng)特性。每處理3個重復。產生飽子數(shù)量的測定方法參照汪章勛[7]等的方法，用5 mm直徑為的打孔器取菌落3塊于含0.05%Tween-80的無菌水中，充分振蕩，用血球計數(shù)板測定飽子數(shù)，最后根據(jù)菌落面積進行換算。

1.2.3 光照對橘青霉生長的影響

橘青霉在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d（28℃），以內徑為5 mm的打孔器打下菌苔，然后將其接種于PDA平板上，分別放于全光照、全黑暗、12 h光暗交替條件下，28℃倒置培養(yǎng)，每個處理3個重復，5 d后測量菌落直徑和產孢量[8]。

1.2.4 pH對橘青霉生長的影響

用1 mol/L的HCI和1 mol/L的NaOH溶液調節(jié)PDA 培 養(yǎng) 基 的 pH， 設 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 pH10個梯度，每個培養(yǎng)皿中接入1個直徑5 mm橘青霉的菌苔，28℃的恒溫箱中培養(yǎng)。每個處理重復3次，5 d后測量菌落直徑[9]。

1.2.5 橘青霉致死溫度的測定

測定方法：取1mL的孢子懸浮液（1×106spores/mL）分裝于9 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的不同試管中，水浴加熱，待溫度上升到預定值時開始計時，并保溫10 min，由40℃開始，以5℃為梯度遞增，直至85℃，然后用移液槍吸取0.1 mL培養(yǎng)液在PDA培養(yǎng)基上涂平板，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，3 d后觀察橘青霉的菌落生長情況。每個處理3個重復[10]。

1.2.6 橘青霉孢子的抗紫外線輻照能力的測定

配制濃度為1×103spores/ml的孢子懸浮液。取0.1 mL上述孢子懸浮液接種到裝有PDA培養(yǎng)基的平板中，涂勻。然后置于超潔凈工作臺中，分別用紫外線照射 1、6、11、16、21 min，不處理的培養(yǎng)作為對照。每個處理3個重復，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3d，統(tǒng)計單菌落個數(shù)，計算致死率。致死率計算公式如下：

1.2.7 試驗數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0版國際通用軟件進行統(tǒng)計分析，計算最小顯著差異（LSD）比較差異顯著性（α=0.05）。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離及鑒定結果

2.1.1 病原菌的分離

試驗結果看出，分離獲得20株病原真菌，回接到冬棗上，均能生產典型的冬棗青腐病病斑。從發(fā)病冬棗上可重新分離得到與所接種菌株培養(yǎng)性狀相同的病原菌，依照柯赫氏法則說明這個菌株即為冬棗青腐病的致病菌。

2.1.2 病原菌的形態(tài)學鑒定

病原菌的形態(tài)學鑒定結果見圖1。

圖1結果看出，病原菌在PDA培養(yǎng)基上菌落生長局限，有放射狀溝紋，大多數(shù)菌系為絨狀，另一些則呈現(xiàn)絮狀，綠色豆。反面黃色至橙色，培養(yǎng)基顏色相仿或帶粉紅色，滲出液呈淡黃色。低倍顯微鏡下分生孢子鏈為明確的分散柱狀。分生孢子梗大多自基質生出，也有自菌落中央氣生菌絲生出者，壁光滑，一般不分枝。帚狀枝由3個～4個輪生而略散開的梗基構成，每個?；洗厣?個～10個路密集而平行的小梗。分生孢子呈球形或近球形，淡綠色，光滑或近于光滑，結合形態(tài)特征及鏡檢結果，參照真菌分類鑒定手冊[11-12]，可初步確認病原菌為半知菌亞門青霉屬的橘青霉系（penicillium citrinum）。

2.2 不同碳源、氮源對病原菌菌絲生長及產孢量的影響

采用硝酸鹽類（NaNO3、KNO3、NH4NO3）、銨鹽類（NH4）2SO4、NH4Cl）、5 種不同的氮源，葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和D-甘露醇5種不同的碳源，研究了它們對橘青霉菌絲體生長及產孢量的影響，結果見表1。

表1 不同氮源、碳源對橘青霉菌絲體生長及產孢量的影響Table 1 Effect of different nitrogen and carbon sources on mycelial growth and spores production of penicillium citrinum

結果表明（見表1），不同的氮源營養(yǎng)和碳源營養(yǎng)對橘青霉的菌絲體生長及產孢量的影響都有顯著性差異（P＜0.05），硝酸鹽類（NaNO3、KNO3、NH4NO3）都有利于橘青霉生長繁殖，而銨鹽類（（NH4）2SO4、NH4Cl）對橘青霉的菌絲體生長及孢子的產生都有較強的抑制作用，如氯化銨（NH4NO3）作為氮源時，橘青霉菌絲體日平均生產速率僅為2.86 mm，7 d后的產孢量為2.69×106spores/mL，明顯低于對照（不加氮源）處理；橘青霉對單糖、雙糖和多糖等碳源均可利用，葡萄糖最有利于橘青霉的菌絲體生產和孢子的產生，而乳糖和D-甘露醇對其生長繁殖具有較強的抑制作用，總之，不同營養(yǎng)條件對冬棗青腐病的病原菌菌絲體生長及孢子的產生都有顯著影響。

2.3 不同光照處理對橘青霉的菌絲體生長及產孢量的影響

不同光照處理對橘青霉的菌絲體生長及產孢量的影響見表2。

表2 光照處理對橘青霉的菌絲體生長及產孢量的影響Table 2 Effect of light treatment on mycelial growth and spores production of penicillium citrinum

表2試驗結果看出，不同光照處理2 d和5 d后，橘青霉的菌落直徑均呈顯著性差異（P＜0.05），全光照時菌落直徑最大，培養(yǎng)5 d后，橘青霉的菌落直徑達23.96 mm，光暗交替條件下次之，而全黑暗條件下菌絲生長最差；不同光照處理5 d后，橘青霉的產孢量也顯著性差異（P＜0.05），全黑暗處理菌株產孢量最多，達到7.78×1010spores/mL?？傊?，光照利于橘青霉菌絲體的生長，而黑暗則對其孢子的產生起促進作用。

2.4 不同pH對橘青霉的菌絲體生長的影響

不同pH對橘青霉的菌絲體生長的影響見圖2。

橘青霉菌絲生長對pH不敏感，在pH2～11的范圍均可生長（見圖2），在偏酸性 PDA 培養(yǎng)基（pH2、3）上，菌絲生長緩慢，在中性及堿性PDA培養(yǎng)基上（pH7、8、9）菌絲生長較快，但堿性過強時菌絲體生長受抑制，結果表明，橘青霉的最適生長pH值為7～8。

2.5 橘青霉致死溫度的測定

由表3可知，隨著處理溫度的升高，橘青霉孢子在PDA平板上長出的菌落數(shù)逐漸減少，培養(yǎng)3 d后，40℃～70℃處理的菌株均能長出菌落，但經75℃處理組未見菌落長出，5 d后觀察結果與3 d后基本保持一致，無新菌落長出。結果表明，在75℃處理，能將橘青霉的分生孢子全部殺死。

表3 橘青霉的致死溫度Table 3 The deadly temperature for penicillium citrinum

2.6 橘青霉孢子的抗紫外線輻照能力的測定

對橘青霉的孢子進行 1、6、11、16、21 min 的紫外線輻照處理，見圖3。

由圖3可以知，隨著紫外輻照時間的延長，菌株的致死率逐漸增加，紫外輻照處理11 min時，橘青霉的致死率才達70%，說明橘青霉孢子的抗紫外線輻照能力較強。

3 結論與討論

青霉屬病原菌引起的冬棗采后貯藏中青腐病，其菌落大多呈灰綠色或青綠色，通常難以描述和區(qū)分。本試驗采用傳統(tǒng)真菌形態(tài)學的鑒定方法.與已報道的鮮棗青霉致病菌的特征進行比對，從而得出病害的主要病原菌為橘青霉。為了更好地防治果蔬采后病害，了解和掌握各種病害病原菌的生物學特性，逐步受到人們的重視。

在氮源、碳源對橘青霉菌絲生長及產孢量的影響試驗中發(fā)現(xiàn)，硫酸氨、氯化氨（氮源）和D-甘露糖、乳糖（碳源）均對其有抑制作用，這些試驗結果將可用于冬棗采后貯藏中病害防治，如應用硫酸氨、氯化氨等作為增效劑來提高化學殺菌劑和生防微生物對冬棗采后貯藏中青腐病的防治效果。光照對青霉菌菌絲體生長及孢子的產生影響差異都顯著，光照利于橘青霉菌絲體的生長，而黑暗則對其孢子的產生起促進作用；橘青霉在pH2～11的范圍內均可生長，在pH6～9范圍內生長良好，最適生長pH為7～8。隨著溫度的升高，橘青霉的致死率迅速上升但達到一定值后，趨勢有所下降，其孢子的致死溫度為75℃左右，對高溫的忍耐能力較強；隨著紫外輻照時間的延長，致死率也逐漸增加，橘青霉的抗紫外線輻照線輻照能力較強，輻照11 min的致死率只有70%。由試驗可知冬棗采后致病青霉菌孢子較耐高溫，特別是新疆塔里木盆地的干旱高溫的秋季，它們適應環(huán)境條件的能力較強，熱處理和紫外線輻照在一定程度上可以延緩或控制冬棗采后病害的發(fā)生，但并不能在根本上起到殺菌的作用，仍然需要采用化學殺菌劑或生物防治等方法配合才能延長冬棗的貯藏期。

綜合分析冬棗采后橘青霉的致病性及生物學特性，研究發(fā)現(xiàn)，溫度、pH、營養(yǎng)條件及環(huán)境條件等是引起冬棗采后病害的關鍵因素。冬棗采后病害的控制應在采前果實近成熟期就采取措施減少潛伏侵染，采收時盡量避免機械損傷，采后以低溫貯藏為基礎，結合高效低毒化學殺菌劑、紫外輻照、熱處理及生物防治技術進行綜合防治，才能有效控制冬棗在貯藏期間的由橘青霉引起青腐病危害。

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