楊芳寧，張慧蕓，康懷彬

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471003）

我國是一個養(yǎng)豬大國，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，養(yǎng)豬業(yè)也得到了飛速的發(fā)展，豬出欄數(shù)和豬肉產(chǎn)量保持逐年增長的勢頭。在生產(chǎn)豬肉的同時會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，豬皮就是其中之一。絕大部分的豬皮都用于制革，可在制革工業(yè)中，大部分皮革邊角余料都被扔掉，而皮革邊角余料的主要成分是膠原蛋白。豬皮中的蛋白質(zhì)含量高達(dá)33%，其中膠原蛋白含量為87.8%[1]。膠原蛋白具有良好的物理性能和生物學(xué)特性，在化工、食品、生物材料等有著廣泛的應(yīng)用[2-3]。膠原蛋白經(jīng)酶解后得到的生物活性多肽也更有利于人體的吸收利用[4]。膠原多肽具有免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、抗氧化等[5-6]生理調(diào)節(jié)功能，2006年全世界膠原肽的年產(chǎn)量已超過20萬t[7]，是極具發(fā)展前景的功能因子和當(dāng)前國際醫(yī)藥學(xué)、食品界最熱門的研究課題[8]。

本研究旨在利用豬皮提取膠原蛋白，采用酶解法提取膠原蛋白多肽，以O(shè)2-·清除率為指標(biāo)，考察時間，酶用量，底物濃度對多肽抗氧化性的影響，確定最佳酶解提取條件，獲得最具抗氧化性的膠原蛋白多肽。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮豬皮：購于洛陽大張超市；胃蛋白酶（1∶3000）：Sigma；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

H2050R高速冷凍離心機、TG16－W微量高速離心機：湘儀離心機儀器有限公司；GLZ－0.2真空冷凍干燥機：上海浦東冷凍干燥設(shè)備有限公司；722S可見分光光度計、JR2002萬分之一電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV－7504單光束紫外分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；HH－S電熱恒溫水浴鍋：江蘇金壇市億通電子有限公司；303－1電熱恒溫干燥箱：江蘇省東臺縣安豐電器廠。

1.3 方法

1.3.1 膠原蛋白的提取

參考周玉恵[9]和朱夕波[10]等研究方法稍作修改。將新鮮豬皮洗凈用手術(shù)刀去皮下脂肪切成0.5 cm×0.5 cm小塊，用pH 7.5的磷酸鹽清洗干凈，再用去離子水浸泡沖洗3次～5次，浸入10%的NaCL溶液中12 h，除去鹽溶性雜質(zhì)，用去離子水洗滌2次～3次，然后分別加入 0.5 mol/L 的 HAc（1∶20，體積比）和胃蛋白酶（1∶20，質(zhì)量比），控制pH在2～3范圍內(nèi)，酶處理72 h后，離心（3 000 r/min）分離取上層清液。在上層清液中加入NaCl進行膠原蛋白鹽析，NaCl濃度為2 mol/L，離心分離（8 000 r/min），沉淀即為膠原蛋白，然后將膠原蛋白重新溶解于0.5 mol/L的HAc，重復(fù)鹽析兩次。將膠原蛋白溶解于0.5 mol/L的HAc中，然后在0.02 mol/L的Na2HPO4（pH8.8）中透析2 d～3 d，所得的膠原沉淀冷凍干燥。

1.3.2 膠原蛋白抗氧化多肽的制備

稱取膠原蛋白加入10 mL蒸餾水溶于錐形瓶中，然后放入90℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為2，稱取胃蛋白酶溶于其中，放置37℃的水浴鍋中開始反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后在沸水浴中加熱5 min滅酶，在8 000 r/min 離心 30 min，取上清液，測定其對 O2－·自由基清除的能力，同時測定膠原蛋白清除力作對照。

1.4 測定方法

1.4.1 羥脯氨酸的測定

緩沖溶液的配制：15 g檸檬酸、7.5 g氫氧化鈉和45 g醋酸鈉用水溶解后，轉(zhuǎn)移至500 mL的容量瓶，然后加入145 mL甘油，用水稀釋至刻度。

氯氨T試劑的配制：取氯氨T 1.41 g溶于100 mL的緩沖液中（放置于5℃的冰箱中可以保存一個月）。

發(fā)色劑的配制：溶解10 g 4－二甲氨基苯甲醛于35 mL 60%的高氯酸中，慢慢地不斷搖動加入65 mL異丙醇（當(dāng)天使用）。

羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：參考刁雪洋[11]和秦玉清[12]等方法稍作修改。研究稱取50 mg羥脯氨酸，用少量水溶解于100 mL容量瓶中滴加一滴3 mol/L硫酸，定容至刻度（標(biāo)準(zhǔn)儲備液：500 μg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用）。移取5 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于500 mL容量瓶中，用水稀釋定容。然后移取 0、10、20、30、40 mL 上述溶液于 100 mL 容量瓶中，定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)溶液的羥脯氨酸濃度分別是 0.00、0.5、1、1.5、2 μg/mL。（其余各步按 ISO 3496：1994（E）羥脯氨酸測定法操作。）空白溶液用蒸餾水代替。取不同濃度的上述溶液4.00 mL，分別加入20 mL具塞試管中，加氯胺T溶液2 mL，搖勻后于室溫放置20 min。加入顯色劑2 mL，搖勻，塞上塞子于60℃試管加熱器（恒溫水浴鍋）中保溫20 min后取出，迅速冷卻，在波長（558±2）nm處測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶法提取膠原蛋白的測定：從離心后的上清液中各吸取5.0 mL于錐形瓶中，分別加入5.0 mL、3 mol/L的H2SO4用保鮮膜封口，蓋上燒杯，放入105℃烘箱中水解16 h，將水解液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶定容至刻度；吸取5.0 mL母液定容至100 mL（稀釋液1）；再吸取10.0 mL稀釋液1定容至100 mL（稀釋液2），其余各步按ISO 3496：1994（E）羥脯氨酸測定法操作。

回收率測定：分別稱取4 g新鮮豬皮，各加入40 mg和120 mg標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸，按上述步驟進行實驗，測定羥脯氨酸含量，計算回收率。每一樣品做3次平行實驗。

1.4.2 O2－·自由基清除能力測定方法

利用鄰苯三酚自氧化體系測定樣品對O2－·的清除能力。取4.5 mL 50 mmol/L pH 8.2的Tris—HCl緩沖溶液，加入0.2 mL樣品溶液，于25℃保溫10 min。然后加入0.3 mL 25℃預(yù)溫的3 mmol/L鄰苯三酚，混勻后迅速加入干燥的比色皿中，在波長320 nm處測定吸光度。每隔30 s測定1次吸光度值。以等量的10 mmol/L HCI代替鄰苯三酚調(diào)零?？瞻捉M以等量的去離子水代替樣液，其它步驟同前。

作出樣品溶液與鄰苯三酚，去離子水與鄰苯三酚混合液在320 nm處吸光度值隨時間的變化曲線。其回歸方程的斜率作為鄰苯三酚的自氧化速率V樣品、V空白（△OD/min）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用sigmaplot10.0軟件對所得實驗結(jié)果作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

如圖1所示，以羥脯氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=0.1888x+0.0008，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，這說明所確定的回歸方程有意義。

2.2 回收率和膠原蛋白提取率測定

由表1可知，實驗建立的羥脯氨酸含量測定方法回收率為77.04%～92.19%，平均回收率為81.69%，證明了實驗的可行性。膠原蛋白含有羥脯氨酸的量一般以占膠原蛋白干重的14%左右來定量測定。根據(jù)前期實驗得到豬皮中羥脯氨酸含量平均值為33.792 mg/g，通過計算得到膠原蛋白提取率為44.46%。這與王川[13]研究結(jié)果得率36.2%相比高出一些，可能是提取方法上略有不同，測定時有些環(huán)境誤差，這也說明了本實驗的可操作性較強。

表1 豬皮膠原蛋白回收率Table 1 The recovery of collagen extracted from pig skin

2.3 酶解條件對膠原蛋白抗氧化多肽制備的影響

2.3.1 酶解時間對酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響

在pH=2，底物濃度為1%，酶用量為底物的2%條件下進行試驗，分別在時間為 0.5、1、2、4、6、7、8、10、12 h下檢測水解產(chǎn)物清除自由基能力大小，清除能力越大，抗氧化能力越強。實驗結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，隨著酶解反應(yīng)時間增加所得酶解產(chǎn)物對自由基清除率有上升趨勢，且在反應(yīng)時間為7 h時清除率最高可達(dá)51.72%，之后在反應(yīng)時間為10 h時清除率又有所上升但均低于7 h的清除率。原因可能是水解時間過長，一些肽段的肽鍵被破壞。由此試驗看出7 h為最佳酶解時間。

2.3.2 酶用量對酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響

在pH=2，底物濃度為1%，酶解時間為7 h的條件下進行試驗，分別在酶用量占底物的1%、2%、2.5%、3%、4%下檢測水解產(chǎn)物清除自由基能力大小，清除能力越大，抗氧化能力越強。實驗結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，不同酶用量下反應(yīng)所得酶解產(chǎn)物對O2－·自由基清除率有所不同，在酶占底物用量為2%時清除率最高可達(dá)44.83%。在底物濃度一定的時候，酶分子越多則酶與底物之間作用頻繁，但隨著酶用量的增加，酶的數(shù)量就趨于過剩，單位時間內(nèi)一部分酶分子不與底物結(jié)合，造成水解程度增加變緩慢。另外，由于酶本身也是一種蛋白質(zhì)，也會發(fā)生酶解，如果量太大了則會干擾酶解物的組成。另外，酶試劑價格較貴，過量添加成本較高。因此試驗得出酶占底物濃度2%為最佳酶用量。

2.3.3 底物濃度對酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響

在pH=2，酶解時間為7h，酶占底物濃度2%條件下進行試驗，分別在底物濃度為1%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、8%下檢測對酶解產(chǎn)物對自由基清除能力大小，清除能力越大，抗氧化能力越強。實驗結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，不同底物濃度下反應(yīng)所得酶解產(chǎn)物對自由基清除率隨濃度增加不斷上升，且在底物濃度為4%時清除率可達(dá)71.03%，而之后隨著底物濃度增加清除率緩慢降低。這可能是由于底物與酶分子結(jié)合達(dá)到飽和，過高底物濃度易造成水解黏度增大，影響蛋白酶擴散，抑制水解反應(yīng)。由此得出底物濃度4%為最佳底物濃度。

圖4 底物濃度對酶解產(chǎn)物清除率的影響Fig.4 The influence of the substrate concentration to the clearance rate of hydrolysates

2.3.4 正交試驗確定酶解提取膠原蛋白抗氧化肽的最佳水解條件

考慮到各因素的相互依賴和相互制約，導(dǎo)致對酶解效果的影響，進行正交試驗以確定各參數(shù)的最佳組合。按正交表L9（34）設(shè)計試驗，以對自由基清除率為指標(biāo)，擬定實驗方案見表來考察3個因素對水解效果的影響，結(jié)果見表2。

表2 豬皮膠原蛋白抗氧化肽制備的正交試驗因素和水平Table 2 Factors and levels for preparation technology of the antioxidant peptides from pig skin collagen

通過正交試驗酶解反應(yīng)正交試驗清除率結(jié)果見表3。由表中極差（R）大小可知，影響清除自由基能力的主次因素順序為酶占底物用量→酶解時間→底物濃度，直觀分析可得最優(yōu)組合為A1B3C2，且極差（R）滿足 RB＞RA＞RC，由此可得因素 A（酶解時間）、因素B（酶占底物用量）、因素C（底物濃度）都對樣品清除自由基能力有影響，即A、B、C均為主要因素。因素B影響最顯著，且B3最優(yōu)，其次因素A應(yīng)選A1最好，而因素C選C2。則較優(yōu)組合應(yīng)為酶解時間6.5 h、酶占底物用量2.5%、底物濃度4%。試驗中沒有出現(xiàn)，且接近3號試驗。經(jīng)驗證實驗所得，在較優(yōu)組合條件下水解產(chǎn)物對自由基清除率可達(dá)72.07%，與實驗結(jié)果相符。同時測定膠原蛋白對自由基清除率只有37.14%，可見膠原蛋白多肽具有較強的清除自由基能力，具有較好的抗氧化性。

表3 豬皮膠原蛋白抗氧化肽制備的L9（34）正交試驗結(jié)果Table 3 Results of L9（34）orthogonal test for preparation technology of the antioxidant peptides from pig skin collagen

3 討論

近年來，水解蛋白質(zhì)提取抗氧化多肽在醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)學(xué)界等備受關(guān)注。Prokomy提出，一些抗氧化肽能降低自動氧化速率和脂肪的過氧化物含量[14]。許多學(xué)者已從多種食物中提取出抗氧化多肽。任俊鳳[15]等通過河豚魚皮水解提取了膠原蛋白抗氧化多肽，其多肽對自由基清除率最高為 53.79%。Eresha Mendis[16]等研究表明，通過章魚皮提取的膠原蛋白多肽具有較強的抗脂質(zhì)過氧化能力。目前為止，已提出多種抗氧化肽，但不同的原料、水解酶以及不同的酶解條件都會影響膠原蛋白肽的抗氧化性。這可能因為不同原料膠原蛋白的氨基酸組成有一些差異，所得多肽也因氨基酸含量不同，抗氧化性也有所不同。另外，不同酶的作用位點不同，所得的膠原蛋白肽的氨基酸組成不同，也影響其抗氧化性的發(fā)揮。本實驗使用相同酶提取膠原蛋白和抗氧化多肽，保持了作用位點前后一致，使得所得膠原蛋白肽的氨基酸組成與前期膠原蛋白的氨基酸組成也具有一定的相似性。但豬皮膠原蛋白明顯沒有優(yōu)化條件下制得的膠原蛋白肽具有較好的抗氧化性，這為進一步研究膠原蛋白抗氧化肽提供了相關(guān)理論依據(jù)。同時也說明了，豬皮膠原蛋白肽具有較強的抗氧化性，可以廢棄的豬皮為原料，開發(fā)一種天然抗氧化劑應(yīng)用于食品、藥品及化妝品中。

4 結(jié)論

采用胃蛋白酶酶解豬皮提取膠原蛋白，操作簡單，易于掌握，且能耗低，無污染，提取的膠原蛋白較好的保存了蛋白的空間結(jié)構(gòu)，平均回收率是81.69%，膠原蛋白提取率可達(dá)44.46%。

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