孟憲昉，白正晨，張弘青

（天津商業(yè)大學理學院，天津300134）

蜂膠中的黃酮醇類化合物是一種具有多種生理功能的天然活性物質。它的主要作用為清除自由基，臨床上具有廣譜抗菌、消炎、抗氧化、增強免疫力、降血壓、降血脂、擴張冠脈、抗心律失常、抗腫瘤等作用，對胃及十二指腸潰瘍、保肝護肝有一定療效[1-5]。但由于其一般不易溶于水，口服吸收差，穩(wěn)定性低，直接影響生物利用度和療效。羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）是一種環(huán)狀化合物，由7個葡萄糖單元形成類似圓柱體結構。圓柱體的空腔內相對疏水性，而其外側則相對親水性。由于這種特殊結構，使得蜂膠中的黃酮醇被其包合后具有較好的水溶性，便于被人體吸收，從而可以大大擴展黃酮醇類化合物的應用范圍[6]。本文就光照、溫度、pH、氧化劑、還原劑、金屬離子以及幾種常見食品添加劑等因素的影響，對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物的穩(wěn)定性進行了研究，確定了蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物的使用與貯存的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

蜂膠：海南卓津蜂業(yè)有限公司提供；羥丙基-β-環(huán)糊精：ACROS，美國；槲皮素標準品、正己烷、鹽酸、Na2SO3、H2O2、NaOH、ZnCl2、AlCl3、FeCl3、SnCl2、CuCl2、VC、蔗糖、檸檬酸、檸檬酸三鈉、苯甲酸鈉、乙醇：均為分析純，購自天津試劑經(jīng)銷公司。

1.2 儀器

島津UV-2501PC紫外可見分光光度計：日本島津公司；旋轉蒸發(fā)器：天津玻璃儀器廠；HZS-H型水浴振蕩器：哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；AUY120電子天平：日本島津公司；電熱恒溫水浴鍋：天津中環(huán)實驗電爐有限公司；DZG-401型電熱真空干燥箱：天津天宇機電有限公司；PHS-3C酸度計：天津市航英科技公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂膠黃酮醇的提取及其和HP-β-CD包合物的制備

取10 g粗蜂膠用玻璃研缽粉碎，與質量分數(shù)為65%的乙醇以 1∶15（g/mL）的固液比混合，于 38℃水浴浸提3次（×4 h），合并提取液，充分抽提后，冷卻，用紗布初濾，再用濾紙過濾，減壓濃縮，回收乙醇，將正己烷和水按1∶4的體積比混合后倒入濃縮液中進行相轉移，將脂溶性成分和水溶性成分分離，水溶性成分上樹脂柱，用質量分數(shù)為60%的乙醇洗脫，然后減壓蒸餾，真空干燥，得黃色粉狀物，即為蜂膠黃酮醇[7-8]。

稱取HP-β-CD 3.70 g于100 mL小燒杯中，加入40 mL蒸餾水，放在電熱恒溫水浴鍋上，60℃熱溶，另取1.4 g蜂膠黃酮醇于100 mL小燒杯中，加入50 mL甲醇于60℃熱溶，將溶解的HP-β-CD移至250 mL雙口燒瓶中，維持50℃，將溶解的蜂膠黃酮醇移至恒壓滴液漏斗中，緩慢滴加至雙口燒瓶中，于60℃回流4 h，關掉升溫裝置，自然降溫并攪拌3 h，靜置過夜，過濾，濾液進行蒸餾，回收甲醇，靜置2 h，過濾，濾液進行濃縮，真空干燥，固體研磨即得產(chǎn)品。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物的顏色反應與紫外光譜分析

將蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物的乙醇溶液滴在濾紙上，干燥后噴1%三氯化鋁乙醇溶液，加熱烘干，于紫外光下觀察其顏色；將蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物溶于1 mL乙醇中，加適量鎂粉，滴加濃鹽酸，觀察其顏色；在試管中加入0.1 mL樣品的乙醇溶液，再加等量的2%硼氫化鈉的甲醇溶液，1 min后加濃鹽酸數(shù)滴，觀察其顏色。取蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物10 mg，用無水甲醇定容到10 mL的容量瓶中，適當稀釋后，在220 nm～400 nm波長范圍內進行紫外吸收波長的掃描。

1.3.2.2 標準曲線的繪制

精確稱取20 mg蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物加適量蒸餾水溶解后轉移到100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。配置系列濃度的蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物水溶液，選擇272 nm處測定其吸光度。

1.3.3 蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物的穩(wěn)定性研究

分別取一定量蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物配制成溶液，測定光照、溫度、pH、氧化劑、還原劑、金屬離子以及幾種常見食品添加劑條件下蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物的吸光度，從而判斷這些條件對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物穩(wěn)定性的影響。

2 結果與討論

2.1 蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物的顏色反應與紫外光譜分析

蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物與三氯化鋁、鹽酸-鎂粉反應均呈陽性，硼氫化鈉還原反應呈陰性，提示為黃酮醇類化合物；紫外光譜在272 nm和320 nm處出現(xiàn)兩個最大吸收峰，顯示有黃酮醇類化合物特征吸收。這與文獻報道一致[9-11]。

2.2 蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物的標準曲線

蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物濃度-吸光度標準曲線[12]，見表 1。

表1 蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物濃度-吸光度標準曲線Table 1 Concentration-absorbance standard curve on inclusion compound of propolis flavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

2.3 光照對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物穩(wěn)定性的影響

稱取一定量蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物樣品配制成0.125 mg/mL溶液，分別取10 mL該溶液于試管中，置自然光和避光兩種情況下進行對比試驗，分別于 0、1、2、3、4 d 時取樣，在 272 mn 波長下測其吸光度，見表2。

表2 光照對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物穩(wěn)定性的影響Table 2 Effect of light on inclusion compound of propolis flavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

結果表明，光照對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物有降解作用，隨著光照時間的延長，降解速度加快，溶液顏色逐漸變淺。在避光條件下降解作用減緩。

2.4 溫度對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物穩(wěn)定性的影響

稱取一定量蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物樣品配制成0.100 mg/mL溶液，分別取10 mL該溶液于試管中，在20℃～100℃溫度下保溫20 min后冷卻至室溫，在272 mn波長下測其吸光度，見表3。

表3 溫度對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of temperature on inclusion compound of propolisflavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

結果表明，70℃以下，蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物的吸光度呈平緩的下降趨勢，當溫度超過70℃時吸光度下降幅度增大，溶液顏色由黃色逐漸變?yōu)榈S色，表明，在20℃～70℃溫度范圍內，蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物的熱穩(wěn)定性較好，應在常溫或70℃以下使用和保存。

2.5 pH對蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物穩(wěn)定性的影響

稱取一定量蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物樣品配制成0.124 mg/mL溶液，分別取10 mL該溶液于試管中，用HCl、NaOH分別調節(jié)pH為1～14，靜置1 h后在272 mn波長下測其吸光度，見表4。

表4 pH對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of pH value on inclusion compound of propolis flavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

結果表明，pH=1～3范圍內蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物的吸光度數(shù)值增大且變化明顯；pH=5～10時吸光度數(shù)值平緩增大；pH=11～12時吸光度數(shù)值增大明顯，溶液顏色加深；pH大于12時，溶液顏色進一步加深并開始出現(xiàn)渾濁。結果表明，在pH較低的酸性條件下，蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物的穩(wěn)定性較差；在pH=5～10時蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物的吸光度變化不大，穩(wěn)定性較好；在較強堿性條件下蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物穩(wěn)定性較差。

2.6 氧化劑對蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物穩(wěn)定性的影響

稱取一定量蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物樣品配制成0.086 mg/mL溶液，選擇H2O2為氧化劑，在食品安全使用范圍內（不超過2.0%）[13]，配制成含不同濃度H2O2的蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物待測液10mL，搖勻靜置，在272 mn波長下測其吸光度，見表5。

表5 氧化劑對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物穩(wěn)定性的影響Table 5 Effect of oxidant on inclusion compound of propolis flavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

結果表明，隨著氧化劑質量分數(shù)的增加，蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物的吸光度略有上升，但上升幅度不大，說明氧化劑對蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物穩(wěn)定性的影響不大，認為蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物具有抗氧化作用。

2.7 還原劑對蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物穩(wěn)定性的影響

稱取一定量蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物樣品配制成0.086 mg/mL溶液，選擇Na2SO3為還原劑，在食品安全使用范圍內（不超過0.05%）[13]，配制成含不同濃度Na2SO3的蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物待測液各10 mL，搖勻靜置，在272 mn波長下測其吸光度，見表6。

表6 還原劑對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物穩(wěn)定性的影響Table 6 Effect of reductant on inclusion compound of propolis flavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

結果表明，隨著還原劑的質量分數(shù)增加，蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物的吸光度略有下降，但下降幅度不大，說明還原劑對蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物穩(wěn)定性的影響不大，蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物具有較好的抗還原性。

2.8 金屬離子對蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物穩(wěn)定性的影響

稱取一定量蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物樣品配制成0.108 mg/mL溶液，分別加入H2O、Fe3+、Sn2+、Al3+、Cu2+和 Zn2+的濃度為 0.05 mg/mL，搖勻，分別放置0、1、2、3、4 d，在 272 mn 波長下測其吸光度，吸光度分別以 A0、A1、A2、A3、A4表示，見表 7。

結果表明，蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物的吸光度受Cu2+和Sn2+的影響而明顯下降，Zn2+幾的吸光度變化與不添加金屬離子的H2O組類似，說明Zn2+對包合物沒有影響，而Fe3+和Al3+對蜂膠黃酮醇和HP－β－CD包合物的吸光度的影響甚微，其吸光度下降的幅度小于不添加金屬離子的H2O組，說明對包合物具有穩(wěn)定作用。

表7 金屬離子對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物穩(wěn)定性的影響Table 7 Effect of metal ion on inclusion compound of propolis flavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

2.9 幾種常用食品添加劑對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物穩(wěn)定性的影響

稱取一定量蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物樣品配制成0.093 mg/mL溶液，在不超過各食品添加劑在食品中的安全使用范圍的基礎上[13]，配置成含不同濃度食品添加劑的蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物待測液10 mL，搖勻，在272 mn波長下測其吸光度，見表8。

表8 幾種常用食品添加劑對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物穩(wěn)定性的影響Table 8 Effect of some food additives on inclusion compound of propolis flavonol with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

結果表明，檸檬酸和VC對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物稍有降解作用，檸檬酸三鈉、蔗糖和苯甲酸鈉對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物的影響甚微。

3 結論

1）通過對產(chǎn)品的紫外光譜分析，其主要化學成分蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物為黃酮類類化合物。

2）在低溫和pH5～10條件下蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物較為穩(wěn)定，當溫度超過70℃以及pH小于5和大于10時其穩(wěn)定性較差。

3）Sn2+、Cu2+以及光照對其具有降解作用，隨著時間的延長，降解速度加快。在貯存和運輸過程中應盡量避免日光照射，并避免與含Sn2+和Cu2+的容器接觸。檸檬酸和VC對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物的影響很小，F(xiàn)e3+、Al3+、Zn2+以及檸檬酸三鈉、蔗糖和苯甲酸鈉對蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物的影響甚微。

4）蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物具有良好的耐氧化性和耐還原性。

5）蜂膠黃酮醇和HP-β-CD包合物以水作為介質，便于人體吸收，在食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)應用更加廣泛。

[1] 郭芳彬.蜂產(chǎn)品中黃酮類化合物的保健作用[J].養(yǎng)蜂科技,2005(2):28-31

[2] Burdock G A.Review of the biological properties and toxicity of bee propolis[J].Food hem toxicol,1998,36(4):347-363

[3] Marcucci M C,Ferres F,Garcia-Viguera,et al.Phenolic compounds from Brazilian propolis woth pharmacological activities[J].Journal of ethnophamacology,2001,74(2):105-112

[4] Arjun H,Banskota,Takema N,et al.Antiproliferative activity of the Netherlands ptopolis and its active principles in cancer cell lines[J].Journal of Enthn-ophamacology,2002,80(1):67-73

[5] 王愛平,賈存英.蜂膠的藥用價值[J].時珍國醫(yī)國藥,1998,9(5):464

[6] 丁平田,吳雪梅.藥物制劑的新型輔料2-羥丙基-β-環(huán)糊精[J].國外醫(yī)學·合成藥生化藥制劑分冊,1996,17(2):10

[7] 白正晨,梁新義,張樹海,等.相轉移催化合成氨基乙酸[J].精細化工,1998,15(4):12-13

[8] 歐陽平,張高勇,康保安.類黃酮提取的基本原理、影響因素和傳統(tǒng)方法[J].中國食品添加劑,2003,60(5):54-57

[9]Yong Kun Park,Masaharu Ikegaki.Preparation of water and ethanolic extracts of propolis and evaluation of the preparations[J].Bioscitechnol Biochem,1998,62(11):2230-2232

[10]趙靜,李熠,薛曉鋒,等.蜂膠高生物活性黃酮組分的研究[J].中國養(yǎng)蜂,2005,56(3):9-10

[11]中國科學院上海藥物研究所,植物化學研究室.黃酮體化合物鑒定手冊[M].北京:科學出版社,1981:389-392,399-400

[12]Alessandro Balbi,Enzo Sottofattori,Teresa Grandi,et al.Synthesis and complernentary complen formation properties of oligonucleotides covalently Linked to new stabilizing agent[J].Tetrahedron,1994,50(13):4009

[13]劉程,周汝忠.食品添加劑應用大全[M].北京:北京工業(yè)大學出版社,1994:131-133