陳志紅，趙媛媛，張守亮，林建揚(yáng)，魏法星，朱偉

(1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇 鎮(zhèn)江212002;2.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013)

目前唯一有效治療終末期器官功能衰竭的方法就是器官移植，但是由于存在器官移植排斥反應(yīng)，傳統(tǒng)的終身免疫治療常常引起各種器官功能衰竭而導(dǎo)致移植失?。?-2]。因而發(fā)展一種新途徑誘導(dǎo)特異性免疫耐受，對(duì)于防止發(fā)生急性和慢性排斥反應(yīng)以及避免器官移植后終身免疫抑制治療都是非常重要的。在器官移植中，T 細(xì)胞是介導(dǎo)移植排斥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，而OX40/OX40L 可以提供T 細(xì)胞活化后進(jìn)一步增殖、分化并最終形成效應(yīng)T 細(xì)胞或者記憶細(xì)胞的關(guān)鍵共刺激信號(hào)［3-5]。因此阻斷OX40/OX40L 間的相互作用，有可能誘導(dǎo)受體針對(duì)移植物抗原的特異性T 細(xì)胞失能從而產(chǎn)生免疫耐受。已有研究表明，阻斷OX40/OX40L 信號(hào)通路可以有限地延長(zhǎng)移植皮膚的存活［6]，對(duì)移植物抗宿主病有潛在治療意義［7]。

本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建含人OX40-IgG1 融合基因的重組腺病毒載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染293A 細(xì)胞，包裝出具有感染性的完整病毒顆粒，進(jìn)一步感染肝HL-7702 細(xì)胞，并檢測(cè)了其感染效率及相關(guān)目的基因和蛋白的表達(dá)。這將為進(jìn)一步進(jìn)行基因誘導(dǎo)免疫耐受從而抑制肝移植排斥反應(yīng)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株 pAdTrack-CMV 穿梭質(zhì)粒由復(fù)旦大學(xué)鐘江老師惠贈(zèng);pAdeasy-1 由本室凍存;大腸埃希菌DHα、BJ5183 菌株由本室凍存;293A 細(xì)胞株來(lái)自加拿大Microbix Biosystems 公司;肝細(xì)胞HL-7702 來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù);小鼠抗人OX40 mAb (1F7)由蘇州大學(xué)張學(xué)光教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 限制性?xún)?nèi)切酶BglⅡ、EcoRⅤ、SalⅠ、PacⅠ、PmeⅠ(New England Biolab 公司);T4DNA 連接酶和TaqDNA 聚合酶(TaKaRa 生物技術(shù)公司);PCR 產(chǎn)物回收試劑盒(Qiagen 公司);質(zhì)粒抽提試劑盒(杭州V-gene 公司);Lipofect Amine 2000 試劑盒(Gibco Brl 公司);小牛血清(Hyclone公司)。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pTOX40Ig 的構(gòu)建 根據(jù)基因庫(kù)公布的人OX40 和hIgG1 Fc 片斷序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，hOX40 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用BglⅡ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，hIgG1 Fc 用SalⅠ和EcoRⅤ進(jìn)行雙酶切，最后pAdTrack-CMV 用BglⅡ和EcoRⅤ雙酶切。然后經(jīng)核酸瓊脂糖凝膠電泳，并用膠回收試劑盒回收體系中hOX40 片段、hIgG1 Fc 片段和pAdTrack-CMV 的DNA 片段，接著將它們?cè)诨蛑亟M連接反應(yīng)體系中16 ～18 ℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，用LB 培養(yǎng)板(卡拉霉素30 μg/mL)篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定過(guò)的陽(yáng)性質(zhì)粒送北京奧科公司進(jìn)行DNA測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pAdTrack-CMVOX40Ig(pTOX40Ig)。

1.2.2 重組腺病毒質(zhì)粒pAdOX40Ig 和pAdGFP 的構(gòu)建 把質(zhì)粒pAdTrack-CMV、pTOX40Ig 分別經(jīng)PmeⅠ單酶切線(xiàn)性化后，進(jìn)行電泳和產(chǎn)物膠回收。膠回收片段與pAdeasy-1 腺病毒質(zhì)粒以氯化鈣法分別共轉(zhuǎn)化BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞。挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR 及PacⅠ酶切鑒定。將鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒pAdOX40Ig、pAdGFP，分別轉(zhuǎn)化DHα 感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化子大量擴(kuò)增保種。

1.2.3 重組腺病毒AdOX40Ig 的制備 用堿裂解法抽提重組腺病毒質(zhì)粒pAdOX40Ig 和pAdGFP，經(jīng)PacⅠ酶切線(xiàn)性化后，按Lipofectamine 2000 操作說(shuō)明轉(zhuǎn)染70%貼壁的293A 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后更換為含5%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，隔2 ～3d 換1 次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)10 ～14d，第3 ～5 天在熒光顯微鏡下觀察熒光。待細(xì)胞有噬斑病變時(shí)收集細(xì)胞懸液，2000 r/min 離心5 min，細(xì)胞沉淀用無(wú)菌PBS 洗滌2 ～3 次后，將細(xì)胞懸液在-80 ～37 ℃間反復(fù)凍融3 次，釋放出病毒，2000 r/min 離心5 min，取上清，經(jīng)多輪感染后獲得高滴度重組腺病毒AdOX40Ig 和空載體病毒AdGFP，于-80℃凍存。

1.2.4 AdOX40Ig 和AdGFP 轉(zhuǎn)染293A 細(xì)胞及RTPCR 鑒定OX40Ig 用AdOX40Ig 和AdGFP 分別轉(zhuǎn)染293A 貼壁細(xì)胞3 h，更換含10%小牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液后在37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)。3d 后提取RNA，采用RT-PCR 鑒定OX40Ig。

1.2.5 AdOX40Ig 重組腺病毒感染效率的檢測(cè)AdOX40Ig 重組腺病毒體外感染HL-7702 細(xì)胞，分為3組，分別為HL-7702 細(xì)胞對(duì)照未感染組、HL-7702 +Ad 空病毒感染組、HL-7702 +Ad-OX40Ig 重組腺病毒感染組，采用1、10、100、200 MOI 劑量感染，實(shí)驗(yàn)各設(shè)3 個(gè)平行孔。48 h 后分別在普通光鏡視野下觀察HL-7702 細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)和熒光視野下觀察GFP 綠色熒光表達(dá)情況，以判斷重組腺病毒不同感染劑量對(duì)HL-7702 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其感染效率，旨在篩選最佳感染劑量進(jìn)行重組腺病毒感染和生物學(xué)功能研究。

1.2.6 間接免疫熒光檢測(cè)外源性O(shè)X40Ig基因的表達(dá) 利用免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠Cy3 進(jìn)行間接免疫熒光，檢測(cè)腺病毒介導(dǎo)的外源性O(shè)X40Ig基因在HL-7702 細(xì)胞中的表達(dá)，方法按免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠Cy3 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.7 AdOX40Ig 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清中OX40Ig 蛋白的測(cè)定 采用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定肝HL-7702 細(xì)胞上清中OX40Ig 含量。在37 ℃下用MOI為10 的AdOX40Ig 對(duì)HL-7702 細(xì)胞感染3 h，收集培養(yǎng)上清，用羊抗人IgG Fc 段單克隆抗體2 μg/mL包被96 孔ELISA 反應(yīng)板，最后經(jīng)ELISA 檢測(cè)儀檢測(cè)450 nm 處D值。同時(shí)設(shè)定完全空白對(duì)照及空載腺病毒AdGFP 對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pTOX40Ig 的鑒定

重組后的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pTOX40Ig 經(jīng)雙酶切后行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與OX40Ig融合基因大小一致，提示轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pTOX40Ig 構(gòu)建成功(圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pTrack-CMV-hOX40Ig(pTOX40Ig)的鑒定Fig 1 Identification of recombinant vector pTrack-CMV-hOX40Ig (pTOX40Ig)by restriction enzymedigestion

2.2 重組腺病毒質(zhì)粒pAdOX40Ig 的鑒定

PacⅠ酶切鑒定重組后的腺病毒質(zhì)粒pAdOX40Ig，能釋放出大小約1300 bp 的片段，提示重組腺病毒質(zhì)粒pAdOX40Ig 已成功構(gòu)建(圖2)。

圖2 重組腺病毒質(zhì)粒的鑒定Fig 2 Identification of recombinant adenovirus plasmid pAdOX40Ig

2.3 重組腺病毒AdOX40Ig 的制備及鑒定

鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒pAdOX40Ig 經(jīng)PacⅠ酶切后，按Lipofectamine 2000 操作說(shuō)明轉(zhuǎn)染293A 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染第3 天在熒光顯微鏡下能觀察到熒光，提示轉(zhuǎn)染成功(圖3)。用pAdOX40Ig 和pAdGFP 分別轉(zhuǎn)染293A 細(xì)胞，培養(yǎng)后采用RT-PCR鑒定OX40Ig。只有AdOX40Ig 組出現(xiàn)1 條大小約1300 bp的條帶，提示重組腺病毒質(zhì)粒AdOX40Ig 已成功制備(圖4)。

圖3 轉(zhuǎn)染293A 細(xì)胞后第3 天重組腺病毒質(zhì)粒pAdOX40IgFig 3 Threedays after recombinant adenovirus plasmid pAdOX40Ig were transfected into 293A cells，green fluorescent protein were observed in cells

圖4 重組腺病毒AdOX40Ig 和AdGFP 的PCR 鑒定Fig 4 Identification of AdOX40Ig and AdGFP

2.4 重組腺病毒AdOX40Ig 的感染效率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普通光鏡下只有200 MOI 劑量感染組細(xì)胞圓縮、脫落，呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，10、100 MOI 劑量病毒感染HL-7702 細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞幾乎無(wú)毒性，而且有很高的感染效率，可達(dá)90%以上，而1 MOI 劑量病毒感染HL-7702 細(xì)胞后雖然無(wú)細(xì)胞毒性但感染效率很低，提示10 MOI 為最佳感染劑量(圖5)。

圖5 重組腺病毒AdOX40Ig 的體外感染效率(×200)Fig 5 Infected efficiency of recombinant adenovirus AdOX40Ig in HL-7702 cells

2.5 人肝細(xì)胞中外源性O(shè)X40Ig 基因的表達(dá)

用AdOX40Ig 重組腺病毒和Ad 空載體腺病毒分別感染HL-7702 細(xì)胞，然后利用免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠Cy3 進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AdOX40Ig 感染組HL-7702 細(xì)胞能檢測(cè)到Cy3 紅色熒光，而Ad 空載體腺病毒感染組和未感染組則未出現(xiàn)紅色熒光。這表明腺病毒介導(dǎo)的外源性O(shè)X40Ig基因能在HL-7702 細(xì)胞中成功表達(dá)(圖6)。

圖6 OX40Ig 基因在HL-7702 細(xì)胞中的表達(dá)Fig 6 OX40Ig gene expression in HL-7702 cells wasdetected by indirect Immuno fluorescence assay

2.6 AdOX40Ig 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清中OX40Ig 蛋白的含量

ELISA 法測(cè)定結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 16.0 分析，空白對(duì)照組OX40Ig 蛋白含量為(2.33±2.52)μg/mL，AdGFP 組為(4.33 ±2.52)μg/mL，AdOX40Ig 處理組為(34. 00 ± 4.58)μg/mL，經(jīng)方差分析，F(xiàn)=88.326，P=0.0001，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為AdOX40Ig 處理組的OX40Ig 蛋白表達(dá)水平高于空白對(duì)照組和AdGFP 組。

3 討論

T 細(xì)胞是介導(dǎo)免疫排斥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，阻斷T 細(xì)胞活化所需的共刺激信號(hào)，有可能誘導(dǎo)受體針對(duì)移植物抗原的特異性T 細(xì)胞失能，從而產(chǎn)生免疫耐受并抑制排斥反應(yīng)的發(fā)生［8]。目前研究最為廣泛的兩條共刺激途徑是CD28/B7 和CD40/CD154 途徑，已證實(shí)同時(shí)阻斷兩條途徑或其中之一可延長(zhǎng)移植物存活［9-11]。另外還有一些新的介導(dǎo)移植物排斥的共刺激途徑如OX40/0X40L 途徑［12]。OX40 是一種跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族，最早發(fā)現(xiàn)其表達(dá)于大鼠活化的T 細(xì)胞表面，后來(lái)證實(shí)也存在于小鼠和人活化的T 細(xì)胞表面。OX40 的配體(OX40L)，屬于2 型糖蛋白TNF家族，研究發(fā)現(xiàn)小鼠的B 細(xì)胞和人的內(nèi)皮細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞的表面均有OX40L 的表達(dá)［13]。兩者結(jié)合形成的OX40/OX40L 是T 細(xì)胞活化后進(jìn)一步增殖、分化，并最終形成效應(yīng)T 細(xì)胞或者記憶細(xì)胞的關(guān)鍵共刺激信號(hào)。因此阻斷OX40/OX40L 途徑能夠抑制T 細(xì)胞的活化和移植物排斥反應(yīng)［14]。

有研究顯示，各種IgG 中，IgG1 的Fc 段與OX40的胞外區(qū)融合所構(gòu)建的融合蛋白與OX40L 親和力最強(qiáng) 。本研究中，我們首先將hOX40 片段、hIgG1 Fc 片段和pAdTrack-CMV 的DNA 片段連接、轉(zhuǎn)化并鑒定構(gòu)建了轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pAdTrack-CMV-OX40Ig(pTOX40Ig)，再與pAdeasy-1 在大腸埃希菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，構(gòu)建成重組腺病毒質(zhì)粒pAdOX40Ig，隨后經(jīng)包裝、擴(kuò)增、純化及鑒定后感染肝HL-7702 細(xì)胞。經(jīng)間接免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示腺病毒介導(dǎo)的外源性O(shè)X40Ig基因能在HL-7702 細(xì)胞中成功表達(dá)，又采用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定AdOX40Ig 感染的HL-7702 肝細(xì)胞上清中OX40Ig 的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AdOX40Ig 處理組高于空白對(duì)照組和AdEGFP 對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，我們已成功構(gòu)建了重組腺病毒載體AdOX40Ig，并且OX40Ig基因及蛋白均可在HL-7702 肝細(xì)胞中成功表達(dá)。這就為肝移植時(shí)將目的基因OX40Ig導(dǎo)入肝細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)使得通過(guò)阻斷OX40/0X40L 途徑抑制肝移植排斥反應(yīng)成為可能。

近年來(lái)在誘導(dǎo)肝移植免疫耐受機(jī)制方面已取得了很大進(jìn)展，但實(shí)際應(yīng)用于臨床的還很少。我們的研究旨在通過(guò)將OX40Ig基因轉(zhuǎn)入移植物的途徑誘導(dǎo)特異性免疫耐受，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行相關(guān)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用等更深入的研究，可能會(huì)在器官移植領(lǐng)域有很好的應(yīng)用價(jià)值。

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