潘皓，韓堯輝，張贏予，毛俊倩，周艷芳，王好，鮑永輝，趙龍，張國輝

(江蘇大學附屬人民醫(yī)院心內科，江蘇鎮(zhèn)江212002)

糖尿病導致的心血管疾病是糖尿病患者健康的主要威脅之一。糖尿病引起的代謝紊亂直接影響心肌細胞、心臟成纖維細胞、內皮細胞的功能，促進心肌細胞的凋亡、壞死，心肌間質膠原的沉積，微血管病變，神經病變等，導致心功能下降，即糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)［1]。DCM 的發(fā)病過程是多因素共同作用的結果［1]，主要包括高血糖，血脂異常，胰島素抵抗，氧自由基產物的增加，細胞內鈣超載等。炎癥反應是糖尿病引起的靶器官損害的病理生理變化中的關鍵環(huán)節(jié)。胞內高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1，HMGB1)作為體內一個多種急、慢性炎癥反應的重要的炎癥介質和炎癥調節(jié)分子，參與了高糖引起的炎癥反應［2-3]。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一個多效性分子，廣泛參與了細胞的增殖、分化、生長以及炎癥和細胞外基質沉積的調節(jié)等多種活動。在各種原因導致的心臟重塑中TGF-β1通路是關鍵的信號通路之一［4]。本研究觀察高糖作用心臟成纖維細胞不同時間后HMGB1、TGF-β1 表達量的變化以及HMGB1 siRNA 對高糖誘導的心臟成纖維細胞TGFβ1 表達量的影響。

1 材料與方法

1.1 動物和主要試劑

健康的3 周齡C57/BL6 小鼠，雌雄不限，由江蘇大學動物實驗中心提供。DMEM 低糖培養(yǎng)基、胰酶(美國Gibco 公司)，標準胎牛血清(美國Hyclone公司)，波形蛋白(vimentin)抗體、鏈霉素親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，轉染試劑RNAiMax、Trizol(美國Invitrogen 公司)，cDNA 第一鏈合成試劑盒、qPCR 擴增試劑盒(加拿大Fermentas 公司)。其余生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代心臟成纖維細胞的分離、培養(yǎng) 拉頸脫臼處死小鼠，75%乙醇浸泡消毒，無菌操作下取心臟，將心臟剪碎成1 mm3大小的碎塊，加入消化液(0.08%胰酶和1%Ⅰ型膠原酶1 ∶1 混合)于37℃水浴，每10 min 收集消化后的上清并用等體積的含20%血清的培養(yǎng)基中和，直至組織塊變透明消失，將收集的細胞離心重懸接種，4 h 后除去未貼壁的細胞，重新加入含10%血清的DMEM 低糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第2 天換液，以后每2 天換液1 次。待細胞長至80%融合時傳代。5 代以后的細胞形態(tài)明顯改變，實驗選擇2 ～4代細胞。高糖培養(yǎng)不同時間(0，6，12，24，48 h)后分別檢測HMGB1、TGF-β1 mRNA 的表達量。

1.2.2 心臟成纖維細胞的形態(tài)觀察和鑒定 顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的心臟成纖維細胞形態(tài)。取傳代后的心臟成纖維細胞嚴格按照試劑盒說明的免疫細胞化學方法進行波形蛋白鑒定。

1.2.3 siRNA 轉染 siRNA 由上海吉瑪公司設計合成，HMGB1 siRNA:上游序列5＇-CUCGUUAUGAAA GAGAAAUTT-3，下 游 序 列5＇-AUUUCUCUUUCAUAACGAGTT-3＇;陰性對照siRNA:上游序列5＇-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3＇，下游序列5＇-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3＇。按照轉染試劑RNAiMax說明操作，最終陰性對照siRNA 和HMGB1 siRNA 的濃度為60 nmol/L。siRNA 干擾24 h后換液。高糖培養(yǎng)6 h 后，分別檢測對照組和HMGB1 siRNA 組的HMGB1 和TGF-β1 mRNA 的表達量。

1.2.4 RT-PCR 檢測成纖維細胞HMGB1、TGF-β1 mRNA 的表達 Trizol 法提取細胞總RNA，以β-肌動蛋白為內參。引物由上海生工合成，HMGB1 上游引 物:5＇-GGGTCACATGGATTATTAGTG-3＇，下 游引 物:5＇-CAGGGCATGTGGACAAAAG-3＇，產 物73 bp;TGF-β1 上 游 引 物:5＇-ACGCCTGAGTGGCTGTCTTTTGAC-3＇，下游引物:5＇-GGGCTGATCCCGTTGATTTCCACG-3＇，產物149 bp;β-肌動蛋白上游引物:5＇-TGGAATCCTGTGGCATCCAGAAAC-3＇，下 游引物:5＇-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3＇，產物349 bp。按試劑盒說明反轉錄合成cDNA，然后以cDNA 產物為模板進行目的片段的PCR 擴增。反應條件:95 ℃10 min，然后95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 個循環(huán)。PCR 產物的特異性通過熔解曲線分析確認。反應結束后，數(shù)據以2-ΔΔCT法表達。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據以均數(shù)±標準差表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.00 進行數(shù)據分析，多組數(shù)據比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。兩組數(shù)據比較采用兩樣本t檢驗。

2 結果

2.1 小鼠心臟成纖維細胞形態(tài)學觀察

原代培養(yǎng)60 min 后即有部分細胞貼壁，呈橢圓形或不規(guī)則形，4 h 后大量細胞貼壁，培養(yǎng)1 ～2d后伸展為梭形或多角形，胞體較大，胞質透明，?？梢? ～3 個核，呈散在生長。3 ～4d 后增殖明顯，開始聚集生長，呈漩渦狀或放射狀(圖1)。傳代后的細胞貼壁速度明顯加快。第5 代以后細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。

2.2 細胞鑒定

培養(yǎng)的成纖維細胞波形蛋白抗原免疫細胞化學染色陽性，胞質呈棕黃色(圖2)。

2.3 高糖培養(yǎng)不同時間對心臟成纖維細胞HMGB1、TGF-β1 mRNA 表達的影響

高糖培養(yǎng)液處理6，12，24，48 h 心臟成纖維細胞的HMGB1 mRNA 表達量明顯上升(F=42. 18，P＜0.01)(圖3)，同時TGF-β1 mRNA 表達量也有增加(F=8.33，P＜0.01)(圖4)。其中在6 h，HMGB1、TGF-β1 mRNA 增加較明顯。

圖1 原代培養(yǎng)小鼠心臟成纖維細胞(×200)Fig 1 The cultured cardiac fibroblasts isolated from C57/BL6 mice(×200)

圖2 心臟成纖維細胞波形蛋白表達情況(免疫細胞化學染色×200)Fig 2 Vimentin presentation of cardiac fibroblasts(immunocytochemical staining×200)

圖3 心臟成纖維細胞高糖培養(yǎng)不同時間后HMGB1 mRNA 的表達Fig 3 The expression of HMGB1 mRNA of cardiac fibroblasts treated by high glucose fordifferent times

圖4 心臟成纖維細胞高糖培養(yǎng)不同時間后TGF-β1 mRNA 的表達Fig 4 The expression of TGF-β1 mRNA of cardiac fibroblasts treated by high glucose fordifferent times

2.4 HMGB1 siRNA 轉染后心臟成纖維細胞HMGB1、TGF-β1 mRNA 的表達

siRNA 組的HMGB1 mRNA 表達量較對照組明顯下降(t=5.40，P＜0.01)(圖5)，這說明HMGB1 siRNA 的轉染是成功的。同時檢測到HMGB1 siRNA 明顯抑制了高糖培養(yǎng)6 h 后心臟成纖維細胞TGF-β1 mRNA 的表達(t= 2.55，P＜0.05)。見圖6。

圖5 HMGB1 siRNA 對高糖培養(yǎng)6 h 后心臟成纖維細胞表達HMGB1 mRNA 的影響Fig 5 The effect of HMGB1 siRNA on the expression of HMGB1 mRNA of cardiac fibroblasts treated by high glucose for 6 h

圖6 HMGB1 siRNA 對高糖培養(yǎng)6 h 后心臟成纖維細胞表達TGF-β1 mRNA 的影響Fig 6 The effect of HMGB1 siRNA on the expression of TGF-β1 mRNA of cardiac fibroblasts treated by high glucose for 6 h

3 討論

本研究對幼年小鼠心臟成纖維細胞的離體培養(yǎng)在傳統(tǒng)方法的基礎上做了一些改進。首先，采用較低濃度的胰蛋白酶和較高濃度的Ⅰ型膠原酶混合的雙酶消化法，膠原酶的使用不僅減小了胰酶對細胞的損害而且有利于消化細胞間質，提高細胞獲得率。其次，我們經過多次試驗發(fā)現(xiàn)每次消化10 min 較合適，消化時間過長會造成細胞不可逆的損害，過短消化不完全，細胞數(shù)量不足。再次，由于非新生鼠的心臟成纖維細胞貼壁時間較長，并且利用酶消化法時非新生鼠的心肌細胞不貼壁，而成纖維細胞是優(yōu)勢細胞可以通過傳代純化，故我們延長了差速貼壁的時間至4 h。最終結果表明，我們獲得了符合實驗要求的細胞。

HMGB1 是與染色體結合的非組蛋白成分之一，可以被分泌至胞外，在胞內胞外發(fā)揮多種生物學功能，并參與多種病理生理過程。在小鼠膿毒癥模型中［5]，HMGB1 的產生晚于TNF-α、IL-1 等炎癥介質，且能反過來刺激TNF-α、IL-1、IL-6 等的釋放，誘發(fā)炎癥擴大的正反饋效應。根據Volz 等［3]的報道，高糖能夠促進心肌細胞、心臟成纖維細胞、巨噬細胞HMGB1 表達增高，HMGB1 作為一個重要的炎癥介質和炎癥調節(jié)因子可能是糖尿病引起炎癥反應的一個新的分子機制。本研究結果亦表明高糖能夠促進小鼠心臟成纖維細胞HMGB1 的表達。同時也發(fā)現(xiàn)高糖能夠促進心臟成纖維細胞TGF-β1 的表達，與Tokudome 等［6]的研究結果一致。心肌纖維化在DCM 的發(fā)生發(fā)展中起著不可忽視的作用，TGF-β1能刺激成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化并促進膠原的合成與分泌，能通過抑制基質金屬蛋白酶的活性和促進金屬蛋白酶組織抑制劑的合成從而促進細胞外基質的沉積，能誘導結締組織生長因子等多種促纖維化相關因子的生成，故TGF-β1 可能在DCM 的發(fā)生發(fā)展中起著不可忽視的作用。

我們使用siRNA 干擾HMGB1 的表達，高糖處理6 h 后心臟成纖維細胞的HMGB1 的表達量下降，同時TGF-β1 的表達量也下降，這說明HMGB1 可能影響高糖誘導的成纖維細胞的TGF-β1 表達。HMGB1 分泌至胞外后與胞膜上的RAGE 結合，通過p38 MAPK、c-Jun N 端激酶(JNK)、細胞外信號調節(jié)激酶1 和2(ERK1/2)等途徑活化下游的核因子κB(NF-κB)，促進TNF-α、IL-1、IL-6 等多種細胞因子的釋放［7]。TNF-α 能夠刺激肺成纖維細胞TGF-β1 表達增高［8]，故對于高糖培養(yǎng)的心臟成纖維細胞，HMGB1 有可能通過TNF-α 促進TGF-β1 的表達，這能在一定程度上解釋我們的實驗結果，但確切的機制還需進一步研究。

綜上，心臟成纖維細胞在高糖培養(yǎng)下HMGB1、TGF-β1 表達增高，siRNA 干擾HMGB1 后TGF-β1表達下降，提示HMGB1 可能參與了高糖培養(yǎng)時心臟成纖維細胞表達TGF-β1 的調節(jié)，這可能是糖尿病時心臟纖維化的重要機制之一。因此針對HMGB1 的治療措施可能有助于抑制糖尿病心肌病的心臟纖維化。未來還需要進一步研究在糖尿病動物模型中是否也存在HMGB1 對TGF-β1 表達的影響。

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