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        類風濕關節(jié)炎患者外周血髓源性抑制細胞的檢測及與Th1/Th2 細胞的相關性分析

        2013-05-07 02:20:58許為民龔愛華王慧花盛浩王旭輝陳艷尤海燕焦志軍
        江蘇大學學報(醫(yī)學版) 2013年2期
        關鍵詞:功能檢測

        許為民,龔愛華,王慧,花盛浩,王旭輝,陳艷,尤海燕,焦志軍

        (1.江蘇大學附屬醫(yī)院檢驗科,江蘇 鎮(zhèn)江212001;2.江蘇大學基礎醫(yī)學與醫(yī)學技術學院,江蘇 鎮(zhèn)江212013)

        類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是以關節(jié)和關節(jié)周圍組織非感染性炎癥為主的、系統(tǒng)性自身免疫性疾病。RA 的發(fā)病機制仍不清楚,目前認為該病的發(fā)生發(fā)展與CD4+T 細胞(Th 細胞)亞群失衡及功能異常密切相關[1-2]。髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是一群分化成熟受阻而形成的異質細胞,可通過分泌誘導性一氧化氮合酶(iNOS)、Ⅰ型精氨酸酶(ARG-1)等抑制T 細胞的增殖和分化[3-4]。此類細胞在RA 外周血中的分布情況尚未見報道。本文擬通過流式細胞術檢測RA 患者外周血中MDSCs 的比例并分析其與Th1/Th2 細胞的相關性。

        1 對象與方法

        1.1 研究對象

        選擇2012年4月至7月于江蘇大學附屬醫(yī)院門診及住院的RA 患者36例,其中,男4例,女32例,年齡30 ~80(51.7 ±12.0)歲。所有病例符合1987年美國風濕病學會診斷標準。根據腫脹關節(jié)數、壓痛關節(jié)數、C 反應蛋白、紅細胞沉降率等臨床檢測指標,計算DAS28 評分,分為2 組:活動組(n =20)和穩(wěn)定組(n =16)。另選江蘇大學附屬醫(yī)院健康查體人員10例作為對照組,男2例,女8例,年齡32 ~75(52.1 ±15.2)歲,無類風濕關節(jié)炎及其他自身免疫性疾病、感染、腫瘤等。以上標本獲取時均取得受試者的知情同意。

        1.2 主要試劑和儀器

        熒光標記的抗體:CD4-PE、IFN-γ-FITC、IL-4-FITC、CD14-PEcy5、HLA-DR-FITC、CD11b-APC、CD33-PE(eBioscience);RPMI-1640、Hanks 液、PBS緩沖液、胎牛血清(Gibco);Ficoll 分離液(Lymphoprep);固定破膜劑(Beckman);流式細胞儀(BD FACS Calibur)。

        1.3 標本采集

        分別抽取RA 患者和健康者外周血3 mL,置于EDTA 抗凝管中。

        1.4 MDSCs 膜表面標志染色

        取100 μL 抗凝全血于流式管中,加入鼠抗人熒光標志CD14-PEcy5、HLA-DR-FITC、CD11b-APC、CD33-PE 各5 μL,室溫避光孵育15 min。加入1 mL溶血劑,混勻,室溫避光,反應10 min。PBS 洗滌,2000 r/min,離心5 min。棄上清,加入200 μL PBS,混勻,用流式細胞儀進行檢測。

        1.5 外周血單個核細胞( peripheral blood mononuclear cell,PBMC) 分離

        取抗凝血2 mL,1500 r/min,離心5 min,吸出血漿后,加入等體積PBS 稀釋、混勻,按照1 ∶1 比例,移至Ficoll 分離液中,2000 r/min,離心10 min,用吸管將白膜層移入無菌玻璃管,用PBS 洗滌,1500 r/min,離心5 min,棄去上清液。用RPMI-1640 培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)調整細胞懸液密度為1 ×106/mL。

        1.6 膜表面標志及胞內細胞因子染色

        在PBMC 懸液中加入2 μL 佛波醇酯(50 mg/L)和1 μL 離子霉素(100 mg/L),于37 ℃和5%CO2孵育箱中培養(yǎng)5 h。取出刺激培養(yǎng)的PBMC,用PBS 離心洗滌后加入5 μL CD4-PE,渦旋混勻,室溫避光孵育15 min。經洗滌、固定和破膜后將樣品分成2 管,分別加入5 μL IFN-γ-FITC 和5 μL IL-4-FITC,混勻,室溫避光孵育15 min。PBS 洗滌,離心,棄去上清,加入200 μL PBS,混勻,用流式細胞儀進行檢測。

        1.7 FCM 檢測分析

        以CD4+INF-γ+的表達比例表示Th1 細胞百分比,以CD4+IL-4+的表達比例表示Th2 細胞百分比,以CD14-HLA-DR-CD33+CD11b+的表達比例表示MDSCs 百分比。結果分析采用Cellquest軟件。

        1.8 統(tǒng)計學分析

        實驗數據采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行分析,多組間均數比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。相關性分析采用Spearman檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 RA 患者外周血MDSCs 的比例

        以CD14-HLA-DR-CD33+CD11b+作為外周血MDSCs 的表面標志,采用流式細胞術四色標志檢測36例RA 患者外周MDSCs 比例,結果顯示,活動組RA 患者外周血中MDSCs 比例(61.14 ±2.68)%明顯高于穩(wěn)定組(48.29 ±3.96)%和對照組(46.91 ±5.01)%(P 均<0.05);穩(wěn)定組雖略高于對照組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖1。

        2.2 RA 患者外周血MDSCs 與Th1、Th2 細胞的相關性

        在檢測MDSCs 的同時,我們檢測了外周血中Th1、Th2 細胞的比例,經Spearman 相關分析,結果顯示,MDSCs 比例與Th1 細胞比例呈負相關(r =-0.424,P=0.0219),而與Th2 細胞比例無明顯相關性(r=-0.213,P>0.05),見圖2。

        圖1 類風濕關節(jié)炎患者外周血中髓源性抑制細胞的檢測結果Fig 1 Detection of myeloid-derived suppressor cells in peripheral blood from patients with rheumatoid arthritis

        圖2 類風濕關節(jié)炎患者外周血MDSCs 與Th1、Th2細胞的相關性分析Fig 2 The correlations between myeloid-derived suppressor cells and Th1/Th2 cell in peripheral blood from patients with rheumatoid arthritis

        3 討論

        MDSCs 是一群具有強免疫抑制功能的異質細胞,通過分泌iNOS、ARG-1、活性氧等產物抑制T 細胞增殖活化,促進T 細胞凋亡,減弱機體的免疫監(jiān)視功能,從而成為機體抗腫瘤免疫的最主要障礙。MDSCs在自身免疫性疾病中也發(fā)揮作用,如Zhu 等[5]、Slaney 等[6]通過對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)動物模型的研究發(fā)現,MDSCs 能夠發(fā)揮免疫抑制作用,緩解EAE 的癥狀。這一發(fā)現使MDSCs 成為近年來研究自身免疫性疾病的新熱點。

        本研究結果顯示,活動組MDSCs 的比例明顯高于穩(wěn)定組和對照組,而穩(wěn)定組雖然在總體上略高于對照組,但是差異無統(tǒng)計學意義。結果表明,RA 患者外周血中MDSCs 的比例增高,尤其在活動期更為明顯。在急慢性炎癥患者和動物模型中(如腫瘤[7-8]、急性移植排斥反應[9]以及自身免疫性疾?。?-6,10]),MDSCs 均有顯著增高,這與本文的研究結果相一致,說明MDSCs 在炎癥狀態(tài)下顯著增多,檢測其比例可作為炎性活動的評估指標。

        根據上述結果,我們推測RA 外周血MDSCs 增多的可能原因如下。在炎癥狀態(tài)下,大量活化的T細胞亞群、異常增多的炎性因子和趨化因子,通過各種途徑,傳遞信號至骨髓,使得骨髓造血干細胞和祖細胞大量增殖,并且將尚未分化成熟的MDSCs 提前釋放入血,當病情穩(wěn)定以后,由于炎性細胞因子的水平降低,可能刺激招募MDSCs 的信號減弱,所以MDSCs 的比例也逐漸降低。

        在本研究中,我們發(fā)現RA 患者的病情越嚴重,MDSCs 的比例越高,增多的MDSCs 似乎未能有效抑制其病情。我們推測可能隨著病情的加重,炎癥局部的炎性因子水平過高,MDSCs 的抑制能力無法與其抗衡;或者致炎細胞及其分泌的細胞因子阻礙MDSCs 進入炎性局部發(fā)揮抑制作用;或者MDSCs 只是受到炎性信號的反饋刺激,僅僅表現為數量上的增多,并無抑制功能;或者MDSCs 本身就是一把雙刃劍,在不同的疾病中,扮演不同的角色,促炎或是抑炎。King 等[11]和Milder 等[12]研究表明,內源性的MDSCs 并不能抑制自身免疫性疾病的發(fā)展,甚至會加重病情。所以,在后續(xù)實驗中,我們將進一步研究MDSCs 在RA 中的具體功能。

        CD4+T 細胞的大量浸潤及其亞群的平衡失調是RA 發(fā)病機制的一個重要環(huán)節(jié)[1-2]。經相關性分析發(fā)現,MDSCs 比例與Th1 細胞比例呈負相關,而與Th2細胞比例無明顯相關性,表明在RA 患者體內,MDSCs 和Th1 細胞功能可能是互相拮抗的,MDSCs 對體內Th1/Th2 平衡的調節(jié)主要在于對Th1 細胞功能的抑制。體外研究[13-14]表明,MDSCs 可抑制Th1 細胞的分化與功能的發(fā)揮。此外,Chou 等[15]指出,MDSCs能促進調節(jié)性T 細胞(regulatory T celll,Treg)的增殖與分化,降低移植胰島的排斥反應,促進移植物存活。在RA 中,MDSCs 抑制功能的發(fā)揮也可能與Treg 細胞有關,值得進一步研究。

        總之,本研究表明,RA 患者外周血中MDSCs 比例增高,且與Th1 細胞呈負相關,有關MDSCs 細胞的功能及其與T 細胞亞群的作用機制有待進一步探討。

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