陶楊晨，繆培智，趙莉芳，高平進(jìn)，顧水明

(1.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212001;2.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院心內(nèi)科，上海200031;3.上海市瑞金醫(yī)院高血壓研究所，上海200031)

血管外膜成纖維細(xì)胞(adventitial fibroblast，AF)被激活后能夠發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從而具有增殖和遷移的功能，參與高血壓新生內(nèi)膜的形成和血管重構(gòu)［1-3]。血管重構(gòu)是高血壓靶器官損害的病理基礎(chǔ)，在高血壓的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，而氧化和炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致血管重構(gòu)的主要因素。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators activated receptor ，PPAR)γ 是一種核受體，被配體激活后可調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。多項(xiàng)研究證實(shí)PPARγ 激活對(duì)心血管疾病發(fā)揮有益的作用，如抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和AF 的遷移等。他汀類藥物具有抗氧化和抗炎的特性［4]。故聯(lián)合使用PPARγ 激動(dòng)劑和他汀類藥物能更有效地對(duì)抗心血管病變。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探討PPARγ 激動(dòng)劑吡咯列酮與他汀類藥物瑞舒伐他汀聯(lián)合應(yīng)用對(duì)血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導(dǎo)的血管氧化及炎癥反應(yīng)的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶等均購(gòu)自Gibco 公司，培養(yǎng)皿購(gòu)自Coming 公司，AngⅡ、吡格列酮購(gòu)自Sigma 公司，瑞舒伐他汀鈣購(gòu)自大連美侖生物有限公司，RT-PCR 反應(yīng)試劑盒購(gòu)自Promega 公司，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亞型一抗購(gòu)自Santa Cruz 公司，二抗購(gòu)自Amersham Life Sciences 公司，電泳遷移材料及轉(zhuǎn)錄因子探針購(gòu)自Invitrogen 公司，PPARγ 及GAPDH引物由上海生物工程公司合成，SD 大鼠由上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取8 周齡的雄性SD 大鼠，分離胸主動(dòng)脈外膜，將其剪碎，貼片于培養(yǎng)皿底部，用含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)AFs，實(shí)驗(yàn)使用傳代培養(yǎng)至第4 代的細(xì)胞。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)NADPH 氧化酶亞型待AFs 長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí)，以無(wú)血清DMEM 處理24 h。實(shí)驗(yàn)分成5 組進(jìn)行:對(duì)照組，AngⅡ組(濃度為10-6mol/L)，PPARγ 激動(dòng)劑干預(yù)組:吡咯列酮(濃度為10 ×10-6mol/L)+AngⅡ，他汀類藥物干預(yù)組:瑞舒伐他汀(濃度為10 ×10-6mol/L)+AngⅡ，聯(lián)合用藥組:吡咯列酮+瑞舒伐他汀+AngⅡ(濃度同上)。AngⅡ誘導(dǎo)24 h，干預(yù)組藥物在AngⅡ誘導(dǎo)前0.5 h 加入。收集上清及細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法蛋白定量，取50 μg 蛋白與上樣緩沖液變性后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，4 ℃100 V 2 h 轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果。5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃一抗孵育過夜(稀釋倍數(shù)分別為羊抗-p22phox，1 ∶200;羊抗-p67phox，1 ∶200)，TBST 洗3 次，每次10 min，結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊的二抗(1 ∶5000 稀釋)，室溫孵育1 h，TBST 洗3 次。用蛋白質(zhì)印跡熒光檢測(cè)試劑盒顯示于X 線片上。用Alphalmager 3400 Imaging 圖像分析系統(tǒng)掃描膠片，以對(duì)照組的面積灰度值為100%與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 電泳遷移 實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)處理同“1.2.2”。收集細(xì)胞，提取細(xì)胞核。設(shè)定的互補(bǔ)寡核苷酸序列:NF-κB，5＇-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3＇;AP-1，5＇-CGCTTGATGACTCAGCCCGAA-3＇。用［γ-32P]ATP，并在T4多聚核苷酸激酶的作用下標(biāo)記探針，放射性標(biāo)記探針與細(xì)胞核提取物在室溫下、50 mmol/L Tris·HCl 緩沖液(pH =7.5)中共同孵育30 min。6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離脫氧核糖核酸蛋白復(fù)合物，在干膠儀器上干燥凝膠，然后用X 光片壓片檢測(cè)。

1.2.4 RT-PCR 測(cè)定PPARγ mRNA 待AFs 長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí)，以無(wú)血清DMEM 處理24 h。實(shí)驗(yàn)分成4 組進(jìn)行:對(duì)照組，瑞舒伐他汀組(濃度為10 ×10-6mol/L)，吡咯列酮組(濃度為10 ×10-6mol/L)，瑞舒伐他汀+吡咯列酮組(濃度同上)。藥物誘導(dǎo)24 h 后收集各組細(xì)胞，提取總RNA，取2 μg 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)PPARγ 引物序列:上游5＇-TGTGAAGCCCATTGAAGACA-3＇，下 游5＇-GAGCGGGTGAAGACTCATGT-3＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為199 bp。RTPCR 反應(yīng)條件:95 ℃溫育15 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán);同時(shí)設(shè)GAPDH 內(nèi)參基因。反應(yīng)結(jié)束后取反應(yīng)產(chǎn)物6 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。用Alphalmager 3400 Imaging 圖像分析系統(tǒng)采集并處理電泳圖，以目的基因與GAPDH 基因灰度比值代表目的基因的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 吡咯列酮和瑞舒伐他汀對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)NADPH氧化酶的作用

見圖1，與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ顯著增加NADPH氧化酶兩個(gè)關(guān)鍵亞型p22phox和p67phox的表達(dá)(P＜0.01);與AngⅡ組相比，瑞舒伐他汀單獨(dú)預(yù)處理組沒有明顯抑制AngⅡ的這種誘導(dǎo)作用(P＞0.05)，而吡咯列酮單獨(dú)預(yù)處理組明顯抑制氧化酶表達(dá)(P＜0.01 或P＜0.05)，并且該兩種藥物合用更顯著地抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的NADPH 氧化酶亞型表達(dá)(P＜0.01)。

2.2 吡咯列酮和瑞舒伐他汀對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的作用

見圖2，與對(duì)照組相比，AngⅡ組顯著增加轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和AP-1 的活性，吡咯列酮預(yù)處理組可明顯抑制NF-κB 的活性，而瑞舒伐他汀預(yù)處理組能明顯抑制AP-1 的活性，吡咯列酮和瑞舒伐他汀聯(lián)合使用能顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的NF-κB 及AP-1 的活性。

圖2 吡咯列酮和瑞舒伐他汀對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的作用Fig 2 Ang Ⅱ-induced transcription factors and modulation by pioglitazone and rosuvastatin

2.3 瑞舒伐他汀對(duì)PPARγ 表達(dá)的影響

見圖3，與對(duì)照組相比，瑞舒伐他汀與吡咯列酮單獨(dú)使用或兩者聯(lián)合應(yīng)用均能顯著地增加PPARγ mRNA 的表達(dá)(P＜0.01)，而瑞舒伐他汀與吡咯列酮聯(lián)合應(yīng)用則更能明顯地增強(qiáng)PPARγ 的表達(dá)水平(P＜0.05)。

圖3 瑞舒伐他汀對(duì)PPARγ mRNA 表達(dá)的影響Fig 3 The effect of rosuvastatin on PPARγ

3 討論

隨著對(duì)高血壓發(fā)病機(jī)制的研究和降壓藥物的發(fā)展，患者血壓的控制已經(jīng)得到明顯改善，但其伴發(fā)的心、腦、血管、腎等靶器官的損害尚未得到很好的控制，因此靶器官損害已成為高血壓治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。心臟和血管的重塑是靶器官損害的共同病理基礎(chǔ)。血管外膜成纖維細(xì)胞向內(nèi)膜下遷移并增殖是血管重塑的重要發(fā)生機(jī)制之一，已知多種血管活性物質(zhì)如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1等均可促進(jìn)AF 遷移活性增強(qiáng)，其中AngⅡ是導(dǎo)致血管重構(gòu)的重要因子。Reddy 等［5]報(bào)道血管外膜存在RAAS 系統(tǒng)，而且外膜在受到損傷刺激后血管緊張素轉(zhuǎn)換酶被激活。Ang Ⅱ通過血壓依賴或不依賴的途徑引起炎癥，并通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激［6]和血管通透性等機(jī)制加速心血管的重塑。

許多研究已經(jīng)證實(shí)，由活性氧自由基(ROS )所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激(OS )是心血管疾病發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)的關(guān)鍵。許多酶可以誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，包括NADPH 氧化酶等，而在心血管系統(tǒng)中，NADPH 氧化酶是血管組織主要的氧化酶，是血管組織活性氧的主要來(lái)源，p22phox和p67phox是NADPH 氧化酶的兩個(gè)關(guān)鍵亞型部件。有研究認(rèn)為，血管外膜AFs 的NADPH 氧化酶可能是血管病變和重塑的先驅(qū)及啟動(dòng)者［7-8]。本研究結(jié)果表明PPARγ 激動(dòng)劑吡咯列酮明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的NADPH 氧化酶亞型的表達(dá)，且兩種藥物合用時(shí)這種抑制作用更明顯。

炎癥反應(yīng)在血管損傷后的修復(fù)中起到關(guān)鍵作用，以往一直認(rèn)為血管損傷后的炎癥反應(yīng)是由內(nèi)膜引發(fā)，并由內(nèi)向外發(fā)展。但近期有研究指出在內(nèi)膜增生前，外膜成纖維細(xì)胞就能合成并分泌炎癥因子和趨化因子，這與其增殖、遷移以及表型轉(zhuǎn)化等密切相關(guān)［9]。AFs 還可以通過釋放活性氧、各種細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等來(lái)影響炎癥反應(yīng)，多種炎癥因子相互作用引起外膜炎癥從而影響新生內(nèi)膜形成和血管重塑。本研究結(jié)果顯示PPARγ 激動(dòng)劑吡咯列酮明顯抑制由AngⅡ刺激產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的活性，瑞舒伐他汀可抑制AP-1 的活性，并且兩種藥物合用效果更佳，而大部分的炎癥因子正是由NFκB、AP-1 等轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)產(chǎn)生的。

有研究證明他汀類藥物能夠通過環(huán)氧合酶(COX )-2 等途徑激活PPARγ 的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用［10]。本研究結(jié)果表明，他汀類藥物聯(lián)合應(yīng)用PPARγ 激動(dòng)劑后，與兩者單獨(dú)作用比較，可進(jìn)一步激活PPARγ 的表達(dá)，表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。這表明兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用可能更有效地控制血管的氧化和炎癥作用。本研究為PPARγ 激動(dòng)劑和他汀類藥物控制心血管病變的臨床聯(lián)合用藥提供了理論依據(jù)。

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