陶京蘭，陸震鳴，4，王宗敏，李國(guó)權(quán)，史勁松，2，許正宏，2，4

1(江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫，214122)2(國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州，646000)3(江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司，江蘇鎮(zhèn)江，214043)4(中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過(guò)程工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300308)

食醋是深受我國(guó)人民喜愛(ài)的一種酸性調(diào)味品。經(jīng)過(guò)數(shù)千年的發(fā)展，食醋的生產(chǎn)遍及全國(guó)各地，其中以山西陳醋、鎮(zhèn)江香醋、四川保寧醋、福建永春老醋等最具代表［1－2］。中國(guó)食醋的釀造采用典型的多菌種混合發(fā)酵工藝，通過(guò)多種微生物的代謝作用產(chǎn)生風(fēng)味飽滿、酸味柔和的食醋。食醋的發(fā)酵過(guò)程主要分為酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵兩個(gè)階段。在酒精發(fā)酵階段，谷物原料如糯米、高粱等經(jīng)過(guò)霉菌和酵母菌的一系列代謝，最終生成酒精;而醋酸發(fā)酵階段則是由多種細(xì)菌和真菌共同參與，將酒精轉(zhuǎn)化為醋酸的過(guò)程［3］，是決定食醋風(fēng)味和品質(zhì)的關(guān)鍵步驟［4－5］。前期研究表明，醋酸菌、乳酸菌和酵母是醋酸發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)功能微生物，在整個(gè)微生物群落中占到 80% 以上［6－8］，因此，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中醋酸菌、乳酸菌和酵母的生物量變化對(duì)于食醋發(fā)酵過(guò)程的控制以及提高產(chǎn)品的風(fēng)味具有重要的生產(chǎn)意義。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，利用熒光信號(hào)累積對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后結(jié)合相應(yīng)的軟件通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法［9］。該技術(shù)已經(jīng)被成功用于復(fù)雜微生物群落中微生物的定量分析，如Persson等應(yīng)用RT-qPCR特異性鑒定了都伯林沙門菌，并將其應(yīng)用于食品質(zhì)量控制［10］。在傳統(tǒng)發(fā)酵食醋的釀造微生物研究方面，已有學(xué)者采用微生物純培養(yǎng)技術(shù)、PCR-DGGE和克隆文庫(kù)分析技術(shù)等對(duì)食醋發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析［11－13］，但是微生物的定量數(shù)據(jù)報(bào)道較少。本研究采用RT-qPCR技術(shù)對(duì)鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵階段的醋醅中總細(xì)菌、總真菌、醋酸菌、乳酸菌和酵母進(jìn)行了定量分析，相關(guān)研究結(jié)果將為食醋釀造機(jī)理解析、發(fā)酵工藝過(guò)程控制奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

醋酸發(fā)酵過(guò)程的醋醅樣品取樣于江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司，每天取樣1次。

RNaseA、蛋白酶K、瓊脂糖、Lysozyme溶菌酶，生工生物工程(上海)股份有限公司;HCl、EDTA、Na3PO4、CTAB、NaCl、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、無(wú)水乙醇，國(guó)藥集團(tuán)股份有限公司;PCR試劑(Takara ExTaq、dNTP等)，EASY Dilution寶生物工程 (大連)有限公司;Ssofast Eva Green預(yù)混液、低位96孔無(wú)裙邊PCR反應(yīng)板、96孔板黏性光學(xué)級(jí)封膜，美國(guó)BIORAD公司。

DNA 提取緩沖液:100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA鈉鹽，100 mmol/L磷酸三鈉，1.5 mol/L NaCl，1%CTAB ，pH 8.0。

TE 溶液:TE Buffer為 10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

C1000 Thermal Cycler、CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀、核酸電泳儀，美國(guó)BIO-RAD公司;DyNA Quant 200核酸濃度測(cè)定儀，美國(guó)PHARMACIA BIOTECH公司;GDS凝膠成像系統(tǒng)，英國(guó)UVP公司;制冰機(jī)，日本SANYO公司;真空干燥儀，美國(guó)SAVANT公司。

1.3 醋醅總DNA的提取

醋醅總DNA提取采用改良的CTAB法。稱取2 g醋醅，用液氮充分研磨3～4次;向研磨的粉末中加入13.5 mL DNA提取緩沖液和100 μL蛋白酶K，37℃，225 r/min水平振蕩30 min;加入3 mL 10%SDS溶液和200 μL 50 mg/mL溶菌酶，65℃水浴2 h(中間顛倒混勻數(shù)次);室溫離心(6 000×g，10 min)，并收集上清液到50 mL離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)搖勻，4℃離心(6 000 × g，7 min)，收集上清液;加入0.6倍體積的異丙醇，室溫沉淀1 h;離心收集沉淀(16 000×g，20 min);用預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀，洗滌、離心(10 000×g，10 min)、干燥;加入 100 μL TE溶液和終濃度為 0.5 mg/mL RNaseA，37℃水浴2 h;－20℃保存。

提取的DNA樣品適當(dāng)稀釋后采用核酸濃度測(cè)定儀確定DNA濃度，分析A260/A280評(píng)價(jià)DNA純度，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的降解程度和RNA消化情況。

1.4 RT-qPCR特異性引物設(shè)計(jì)

針對(duì)醋醅中總細(xì)菌、總真菌、醋酸菌、乳酸菌和酵母分別設(shè)計(jì)特異性引物(表 1)［3，14］，用于 RT-qPCR擴(kuò)增。

表1 微生物特異性引物的名稱及序列Table 1 Names and sequences of specific primers

1.5 醋醅微生物的RT-qPCR定量分析

RT-qPCR反應(yīng)體系:Ssofast Eva Green Mix 10 μL，引物各 1.0 μL，模板 10 ng，加 ddH2O 至 20 μL。

RT-qPCR反應(yīng)程序:95℃ 10 s;95℃ 5 s，最佳退火溫度(表1)10 s，40個(gè)循環(huán)。然后體系從65℃升溫至95℃，每隔0.5℃讀一次板，每次維持0.05 s，繪制熔解曲線。

微生物的定量采用絕對(duì)定量法，即采用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)未知濃度的樣品進(jìn)行其拷貝數(shù)的測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)品為含有目的片段的單拷貝克隆質(zhì)粒［15］。標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算:

其中:c標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度(copies/μL);OD260nm，由核酸濃度測(cè)定儀3次測(cè)定的平均值;A，換算系數(shù)0.05，即1 OD260nm=0.05 μg/(μL dsDNA);N，稀釋倍數(shù);6.02×1023，阿佛加德羅常數(shù)。

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，然后以標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)完成時(shí)，以閾值循環(huán)數(shù)Ct(即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))作為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以醋酸發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間的醋醅樣品總DNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR特異性擴(kuò)增，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算醋醅中各類微生物的拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋醅樣品總DNA的提取分析

采用改良的CTAB法提取醋醅樣品總DNA，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果(圖1)，核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定其濃度(表2)，可知DNA電泳條帶都較整齊、清晰，均無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，表明總DNA完整且無(wú)明顯降解;A260/A280比值在1.8左右，總DNA質(zhì)量較高，可用于RT-qPCR分析。

圖1 醋醅樣品總DNAFig.1 Total DNA of the vinegar fermentation culture M:λ-Hind III digest DNA Marker，1－19:total DNA of the vinegar fermentation culture samples

表2 醋醅樣品總DNA的A260/A280比值Table 2 A260/A280of total DNA of the vinegar fermentation culture

2.2 RT-qPCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線

本實(shí)驗(yàn)中各類微生物的RT-qPCR擴(kuò)增曲線為典型的倒S曲線，基線平整，指數(shù)區(qū)較明顯且陡度大，平臺(tái)區(qū)能夠匯于一起，線性范圍較寬?？偧?xì)菌、總真菌、醋酸菌、乳酸菌、酵母的反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線如圖2所示。熔解曲線呈現(xiàn)單一熔解峰，說(shuō)明無(wú)引物二聚體及非特異性產(chǎn)物;曲線平穩(wěn)，說(shuō)明各濃度質(zhì)粒的熔解溫度均一，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好(R2=0.992 4～0.997 7)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍分別為:總細(xì)菌1.96×1012～1.96×103;總真菌6.18×1012～6.18×103;醋酸菌1.94×1012～1.94×103;乳酸菌6.92×1012～6.92×103;酵母菌8.18×1010～8.18 ×101。

2.3 醋酸發(fā)酵階段微生物生物量的動(dòng)態(tài)變化

醋酸發(fā)酵階段各類微生物生物量的變化如圖3所示。發(fā)酵起始階段(1～7天)，醋醅中總細(xì)菌、醋酸菌和乳酸菌的生物量快速上升，分別于第6、7、4天達(dá)到最大拷貝數(shù)，為4.85×1011，1.14×1010和3.37×1011copies/g干醅。隨后各類細(xì)菌的生物量逐漸下降，并維持在一定數(shù)量級(jí)(108～109)。醋醅中總真菌、酵母的生物量在發(fā)酵前期(1～7 d)變化不大，并維持在一定水平(107～1010)。總真菌的生物量在第7天后逐漸下降，由發(fā)酵起始的1.20×1010copies/g干醅下降為發(fā)酵結(jié)束時(shí)的7.59×104copies/g干醅，而酵母的生物量則在發(fā)酵8～12 d內(nèi)下降為0。

由結(jié)果可知，醋酸菌和乳酸菌占醋醅中細(xì)菌總量的80%以上，是釀醋主體功能性微生物，兩者可利用酒精生成乙酸和乳酸等構(gòu)成食醋主體風(fēng)味的有機(jī)酸。另外，鎮(zhèn)江香醋采用分層翻醅的獨(dú)特釀造工藝，在發(fā)酵起始階段，醋醅的中、下層由于未翻醅而形成厭氧或痕量氧的環(huán)境，適合乳酸菌等兼性厭氧微生物快速繁殖，于第4天達(dá)到最大生物量，而醋酸菌等好氧微生物則在第7天達(dá)到最大生物量。醋酸發(fā)酵階段醋醅中的酵母主要來(lái)自于酒精發(fā)酵階段的酒醪，其具有發(fā)達(dá)的酶系，可在醋酸發(fā)酵過(guò)程中起到降解底物以及催化醋酸發(fā)酵時(shí)生成的有機(jī)酸與酒精發(fā)酵階段生成的醇類生成眾多酯類等風(fēng)味物質(zhì)。發(fā)酵第8天后酵母的生物量快速下降，可能是由于酸性環(huán)境的抑制作用所致。

3 結(jié)論

RT-qPCR具有速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高、交叉污染少、自動(dòng)化程度高、全封閉反應(yīng)以及定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和環(huán)境等研究領(lǐng)域。本文通過(guò)RT-qPCR的定量分析，證實(shí)了醋酸菌、乳酸菌和酵母為醋醅中的主體微生物，三者占細(xì)菌和真菌總和的80%以上。醋酸發(fā)酵階段醋醅中總細(xì)菌、醋酸菌和乳酸菌的生物量均呈現(xiàn)先上升后下降至一定水平的變化趨勢(shì)。其中，醋酸菌和乳酸菌的生物量分別在第7天和第4天達(dá)到最大拷貝數(shù)，為細(xì)菌中主要微生物?？傉婢徒湍冈诎l(fā)酵起始階段變化不大，總真菌的生物量在第7天后逐漸下降，而酵母的生物量則在發(fā)酵8～12 d內(nèi)下降為0。醋酸菌、乳酸菌和酵母作為醋酸發(fā)酵過(guò)程中的主要微生物，其功能有待進(jìn)一步研究。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線Fig.2 Standard curve and melting curve of the microorganism

圖3 醋酸發(fā)酵過(guò)程中微生物動(dòng)態(tài)變化曲線Fig.3 Dynamic curve of the microorganism during the fermentation process

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