陳淑芬，郭麗萍，金燕

1(蘭州石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院 石油化學(xué)工程系，甘肅，蘭州，730060)2(賽默飛世爾科技中國有限公司應(yīng)用研究中心北京實(shí)驗(yàn)室，北京，100080)

VB12又稱鈷胺素，是一種水溶性維生素［1］。VB12以輔酶形式參與代謝過程，促進(jìn)DNA和蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)細(xì)胞的成熟，維持神經(jīng)組織的正常功能，缺乏VB12時(shí)會(huì)產(chǎn)生惡性貧血、神經(jīng)系統(tǒng)的損害［2］。VB12的主要來源是動(dòng)物性食物，如動(dòng)物肝臟、牛肉、豬肉、蛋、牛奶、乳酪，而VB12的含量非常微量，添加維生素的飲料中含量僅為0.2～20 μg/L。含量過低，是用高效液相色譜法測定飲料中VB12含量的難題［1］。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的VB12測定方法主要有微生物法［3］、熒光法、高效液相色譜法［4］、凝膠色譜-高效液相色譜法等。而微生物法操作繁瑣，時(shí)間較長;熒光法穩(wěn)定性不夠好;現(xiàn)有的高效液相色譜法僅適用于測定含量高的預(yù)混料;凝膠色譜-高效液相色譜法使用的凝膠凈化柱特異性較強(qiáng)，但價(jià)格昂貴［1］。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.217－2008保健食品中VB12的測定雖列于適用于功能性飲料檢測，方法檢出限為3 μg/L，但采用的是免疫親和柱，成本高，且對(duì)于飲料中添加量低于1.0 μg/L的樣品按取樣25 mL進(jìn)行檢測，檢出限仍達(dá)不到要求。也有文獻(xiàn)報(bào)道使用離線固相萃取-高效液相色譜法對(duì)微量VB12進(jìn)行離線除雜及濃縮后再進(jìn)行檢測［1，5］。

本文利用雙泵技術(shù)、閥切換技術(shù)和在線固相萃取技術(shù)，通過在線固相萃取柱的特殊選擇性保留VB12和部分干擾物，在線將絕大多數(shù)干擾物質(zhì)排出，然后通過閥切換使用另一個(gè)泵將VB12反沖到分析柱上進(jìn)行檢測。方法操作方便、靈敏度高、耗時(shí)短、重現(xiàn)性強(qiáng)，對(duì)VB12的檢出限可以達(dá)到 0.54 μg/L，回收率達(dá)101.29%。該方法具有很好的可操作性，可以用于功能飲料等復(fù)雜液體樣品中VB12的檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品

市售功能性飲料。

1.2 主要試劑

VB12(J＆K，對(duì)照品，純度 98%);乙腈(Thermofisher，HPLC 級(jí));三氟乙酸(Dikma，HPLC 級(jí)，純度99.5%);實(shí)驗(yàn)用水均為電阻率為18.2 MΩ cm的去離子水。

1.3 儀器及設(shè)備

Ultimate 3000雙梯度高效液相色譜(Thermofisher，美國)，包括雙泵(DGP)模塊、自動(dòng)進(jìn)樣器(AS)模塊、柱溫箱(TCC)模塊;雙泵模塊中包含2個(gè)獨(dú)立的三通道梯度泵，可分別用于梯度洗脫進(jìn)行樣品分析;柱溫箱模塊中放置在線固相萃取柱和分析柱，溫度設(shè)為30℃，并置一個(gè)二位十通閥，可用于流動(dòng)相和柱子之間的切換;檢測器是二極管陣列檢測器(Thermofisher Ultimate 3000);Chromeleon 7.1色譜工作站(Thermofisher，美國);超純水設(shè)備(Barnstead，Thermofisher，USA)。

1.4 溶液的制備

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的配制

精確稱取42 mg的VB12標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用超純水溶解并定容至25 mL，制成1 680 mg/L濃度的VB12標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并依次稀釋成 1.05、3.15、5.04、10.08 及20.16 μg/L 濃度的 VB12標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別經(jīng) 0.45 μm的濾膜過濾后裝瓶，待測。

將功能飲料經(jīng)過2層0.45 μm的濾膜過濾后裝瓶，待測。

1.4.2 色譜條件

在線固相萃取色譜柱:Thermofisher IonPac NG1柱(4 mm ×35 mm)。

分析色譜柱:Thermofisher Acclaim PAII C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm)。

采用梯度淋洗，在線固相萃取色譜柱條件見表1，分析色譜柱條件見表2，閥切換時(shí)間見表3，儀器連接見圖1。檢測波長為220 nm。柱溫30℃。進(jìn)樣體積為 1 000 μL。

圖1 儀器連接圖Fig.1 Graph of HPLC connection

表1 測定功能飲料中VB12在線固相萃取柱的梯度淋洗程序Table 1 Gradient conditions of SPE column for determination of Vitamin B12in Functional Drink

表2 測定功能飲料中VB12分析柱的梯度淋洗程序Table 2 Gradient conditions of analysis column for determination of Vitamin B12in Functional Drink

表3 測定功能飲料中VB12的閥切換程序Table 5 Valve switching conditions for determination of Vitamin B12in Functional Drink

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

在200～600 nm對(duì)VB12標(biāo)準(zhǔn)品的光譜吸收進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，λ=220 nm時(shí)，VB12有較大吸收，所以選擇220 nm為檢測波長。

2.1.2 色譜柱的選擇

由于VB12在反相色譜柱上保留能力很強(qiáng)，所以選用C18機(jī)制的Thermofisher Acclaim PAII色譜柱作為分析柱，選用乙腈及0.025%三氟乙酸水溶液作為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫。

由于VB12在功能飲料中的含量一般在10 μg/L左右，濃度比較低，如果直接進(jìn)行高效液相色譜分析，需要增大進(jìn)樣體積才能檢測到該濃度的VB12，可能會(huì)超出色譜柱的承受范圍，導(dǎo)致色譜柱壽命減短，而且由于飲料中大量的干擾物質(zhì)存在，很難對(duì)該濃度下的VB12進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測。如果對(duì)功能飲料樣品中的VB12進(jìn)行離線反相固相萃取處理后，會(huì)很大程度上富集樣品并降低干擾，但是處理起來比較繁瑣，耗時(shí)。

本方法在固相萃取原理的基礎(chǔ)上，采用Thermofisher雙梯度液相色譜儀器特有的雙泵技術(shù)和在線閥切換技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行在線固相萃取后進(jìn)入分析柱進(jìn)行分析，過程中避免了手動(dòng)操作的誤差及節(jié)省了離線處理的步驟，操作簡單(在線固相萃取結(jié)果見圖2)。

圖2 在線固相萃取后功能飲料與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比圖(1為10 μg/L VB12標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果，2為功能飲料檢測結(jié)果)Fig.2 Chromatography overlaid of Functional Drink with standard addition and standard with online SPE HPLC

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性、線性范圍及重現(xiàn)性

按照在線固相萃取方法優(yōu)化后的液相色譜條件，進(jìn)樣體積可以增大到1 000 μL，對(duì)VB12標(biāo)準(zhǔn)品分析，所得檢出限(S/N=3)、線性范圍數(shù)據(jù)列于表4。該方法用于VB12的檢測，靈敏度高，VB12的檢出限在0.54 μg/L(1 000 μL進(jìn)樣);線性范圍較寬(1.05～20.16 μg/L)。由于每次分離結(jié)束后增加了一定時(shí)間的色譜柱平衡程序，大大提高了測定結(jié)果的重現(xiàn)性，VB12(濃度為10.08 μg/L)連續(xù)5次進(jìn)樣時(shí)保留時(shí)間的RSD＜0.01%，連續(xù)5次進(jìn)樣峰面積的RSD＜0.9%，具體數(shù)據(jù)列于表5。

2.2.2 回收率考察

在功能飲料樣品中加標(biāo)制成加標(biāo)10 μg/L VB12的功能飲料樣品，按照改進(jìn)后的在線固相萃取色譜方法進(jìn)行檢測，得到回收率可達(dá)101.29%，說明在線固相萃取過程中，基本上沒有造成VB12的損失，此在線固相萃取方法可以用于實(shí)際飲料中VB12的檢測。

2.3 樣品測定

精確量取樣品適量，按1.4.1條件處理樣品后，再按照1.4.2色譜條件測定樣品中VB12含量。結(jié)果顯示，功能飲料中含有5.6 μg/L的VB12，在功能飲料的標(biāo)識(shí)含量范圍內(nèi)。

表4 VB12的檢出限及線性范圍Table 4 Detection limits and linearity of Vitamin B12

表5 10.08 μg/LVB12的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)Table 5 Repeatability data of 10.08 μg/L VB12

3 討論

本文根據(jù)Thermofisher IonPac NG1色譜柱對(duì)于VB12和干擾物的選擇性不同，選擇Thermofisher IonPac NG1色譜柱作為在線固相萃取柱，將VB12和少量干擾物保留在在線固相萃取柱中，大部分干擾物被排除，然后通過另一個(gè)泵將被保留的VB12和少量干擾物反沖到分析柱中進(jìn)行分析，很大程度上降低了干擾，增加了靈敏度，檢出限達(dá)到0.54 μg/L。本文使用雙泵和閥切換技術(shù)將在線固相萃取技術(shù)應(yīng)用于功能飲料中的VB12的檢測，VB12的回收率達(dá)101.29%。該方法具有很好的可操作性，可以用于功能飲料等復(fù)雜液體樣品中VB12的檢測。

［1］ 周芳梅，蔡雙福，文燦，等.固相萃取-高效液相色譜法測定飲料中維生素B(12)［J］.現(xiàn)代食品科技，2010，26(7):759－762.

［2］ 羅祎，郝常明.VB12的研究及其進(jìn)展［J］.中國食品添加劑，2002(3):15－19.

［3］ GB 5413.14－2010.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定［S］.

［4］ GB/T 17819－1999.維生素預(yù)混料中維生素B12的測定高效液相色譜法［S］.

［5］ 李紅艷，王瑾，邵亮亮，等.固相萃取-高效液相色譜法測定功能性飲料中微量維生素B-12［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(3):384－386.