李恒，孫夏冰，陸震鳴，3，王松濤，沈才洪，許正宏，，3，史勁松，

1(江南大學 藥學院，江蘇無錫，214122)2(國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川瀘州，646000)3(中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室，天津，300308)

我國濃香型白酒的生產(chǎn)以泥窖窖池為基礎，以窖泥為關鍵材料［1－2］。窖泥是受人為活動影響較大的一類特殊土壤，其老熟程度直接影響著曲酒的質(zhì)量［3］，其中含有豐富的己酸菌，發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生大量的己酸，進而與乙醇反應生成濃香型大曲酒的主體香——己酸乙酯［2，4］。

千百年來，濃香型白酒的釀造以傳統(tǒng)工藝的傳承為主，其生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制主要依靠經(jīng)驗，對窖泥質(zhì)量的鑒定長期以來主要依靠感官鑒定以及一些理化指標的分析數(shù)據(jù)［2］，如對窖泥中的氮、磷、鉀等元素的分析［3］，以及發(fā)酵過程中的溫度、水分、還原糖等含量的測定［5］。傳統(tǒng)的分析方法受分析儀器的限制，僅僅能夠獲得窖池中部分物質(zhì)成分的信息，對于許多風味化合物，尤其是微量物質(zhì)無從獲知，嚴重制約了我國傳統(tǒng)白酒行業(yè)的健康發(fā)展?，F(xiàn)代分析技術的發(fā)展大大促進了有關窖泥中的揮發(fā)性化合物、有機酸、氨基酸、脂肪酸等風味物質(zhì)的分析研究，包括氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用、毛細管電泳等。這些儀器分析技術為研究傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的風味化合物提供了有力的分析手段，且靈敏度高、重復性好、信息量大、分析速度快［6－7］。固相微萃取(SPME)的出現(xiàn)，進一步提高了對于窖泥這類復雜基質(zhì)中揮發(fā)性化合物的檢測精度。SPME技術是一種快速分析技術，集樣品預處理、吸附萃取等于一身，所需樣品量微量，分析時間短，非常適合于白酒以及白酒生產(chǎn)過程中的微量成分的檢測分析、過程監(jiān)控等［2］。目前，頂空固相微萃取(HS-SPME)與氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用的方法已成功應用于白酒等飲料中揮發(fā)性組分的分析［8－10］。

瀘州老窖是濃香型白酒的典型代表，其產(chǎn)品獨特風味的形成主要是窖泥中多種微生物共同作用的結果［11］。已有學者對窖泥中微生物的群落結構［12］、風味物質(zhì)的組成［13］、不同窖齡老窖生產(chǎn)白酒的風味差異［7，12－13］等進行了研究報道。上述研究對窖泥揮發(fā)性物質(zhì)的分析主要采用傳統(tǒng)的溶劑萃取法，檢測到的化合物種類有限。此外，現(xiàn)有研究多關注于窖池窖齡對于白酒風味的影響，很少關注窖池內(nèi)部的空間位置可能對風味物質(zhì)組成產(chǎn)生的影響。本研究建立了HS-SPME/GC-MS法用于窖泥揮發(fā)性化合物的分析，并分析了窖池中不同部位窖泥揮發(fā)性成分的差異以及對風味物質(zhì)形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

窖泥樣品分別取自瀘州老窖50年窖齡窖池的窖壁與窖底。

Finnigan TRACE GC-MS，美國 Finnigan公司;SPME萃取頭、手動進樣手柄，美國Supelco公司;頂空進樣瓶，中國安譜公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 窖泥樣品及其前處理

取0.5 g窖泥放入頂空瓶中，加入5 mL煮沸10 min并冷卻至室溫的蒸餾水與2 g NaCl，再加入2 μL的2-辛醇(1.64 g/L)作為內(nèi)標，旋緊瓶蓋。

1.2.2 頂空固相微萃取(HS-SPME)條件

將裝有窖泥樣品的頂空瓶置于55℃水浴鍋中，用固相 CAR/PDMS(75 μm CAR/PDMS，碳分子篩/聚二甲基硅烷)萃取纖維頭插入硅膠塞，于50℃插入窖泥樣品的飽和NaCl樣品中頂空吸附30 min，于250℃解吸1 min后進行GC-MS分離鑒定。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜(GC－MS)分析條件

氣相色譜條件:色譜柱:PEG 20M毛細管柱(Φ 0.25 mm × 0.25 μm × 30 m);載氣:氦氣，1.0 mL/min;程序升溫條件:40℃維持3 min，5℃/min升溫至60℃，10℃/min升溫至230℃，維持8 min。

質(zhì)譜條件:電離源溫度:200℃;電離電勢:70 eV;離子化模式:EI+;放射電流:200 μA;檢測電壓:350 V。

1.2.4 定性方法

物質(zhì)定性利用GC-MS Postrun Analysis軟件完成，未知化合物經(jīng)計算機檢索的同時與NIST08譜庫和NIST08s譜庫的相匹配，匹配度大于95%的鑒定結果才予以確認。

2 結果與討論

2.1 窖泥中揮發(fā)性化合物的種類及比例

采用HS-SPME與GC-MS聯(lián)用的方法檢測瀘州老窖50年窖齡窖池中窖壁窖泥與窖底窖泥中的揮發(fā)性組分，其總離子流圖譜如圖1所示，詳細分析結果與統(tǒng)計結果分別見表1與圖2。

從瀘州老窖50年窖齡窖池的窖泥中共檢測出65種揮發(fā)性化合物，其中窖壁窖泥53種，窖底窖泥49種。這些揮發(fā)性組分主要分為5大類，包括酯類、醇類、酸類、醛酮類及酚類化合物。窖壁窖泥中五大類揮發(fā)性組分占總峰面積的98.45%，其中，醇類化合物12種，占總峰面積的24.52%，酸類化合物5種，占總峰面積的17.24%，酯類化合物22種，占總峰面積的51.58%，醛酮類化合物9種，占總峰面積的4.09%，酚類化合物3種，占總峰面積的1.02%;窖底窖泥中五大類揮發(fā)性組分占總峰面積的97.63%，其中，醇類化合物14種，占總峰面積的29.35%，酸類化合物1種，占總峰面積的0.85%，酯類化合物17種，占總峰面積的59.82%，醛酮類化合物11種，占總峰面積的6.17%，酚類化合物3種，占總峰面積的1.44%。

圖1 GC/MS分析50年窖齡的窖池中不同部位窖泥中的主要揮發(fā)性組分總離子流圖(含內(nèi)標)Fig.1 The total ionic chromatogram of main volatile constituents in the pit muds from different parts of Luzhou Laojiao cellar with 50 years using GC/MS method(with the internal standard)

2.2 不同部位窖泥中主要揮發(fā)性化合物的差異分析

2.2.1 醇類化合物

醇類化合物由微生物作用于糖、果膠質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)而產(chǎn)生，是酒體中微量香味物質(zhì)的基本組成部分［14］，在窖泥的揮發(fā)性成分中含量僅次于酯類化合物(圖2)。由分析結果可知，窖泥中的醇類化合物主要由乙醇和一些高級醇(C4～C10)構成，且窖壁窖泥與窖底窖泥中醇類化合物的種類相差不大。窖底窖泥中醇類化合物的相對含量高于窖壁窖泥約5%，主要是由乙醇和1-己醇這兩種含量最多的醇類化合物的差異所引起，窖底窖泥中的乙醇與1-己醇的相對含量分別比窖壁窖泥中高出1.22%和2.17%。

醇類化合物同時也是其他香味成分的基礎，可進一步轉(zhuǎn)化生成酸類、酯類等呈香呈味物質(zhì)。

2.2.2 酸類化合物

在本實驗所分析的50年窖齡的窖泥樣品中，酸類化合物是存在顯著差異的一類揮發(fā)性組分。從窖壁窖泥中共檢測出丁酸、戊酸、己酸、己酸酐以及氫化肉桂酸5種酸類化合物，而窖底窖泥中僅檢測到己酸的存在。此外，作為酸類化合物的主要成分，己酸在窖壁窖泥與窖底窖泥中的分布存在顯著區(qū)別。窖壁窖泥中的己酸含量高達16.20%，占酸類化合物總量的93.97%，是窖底窖泥中含量的19.0倍。

表1 瀘州老窖50年窖齡窖池中窖泥所含的揮發(fā)性化合物組成Table 1 The volatile constituents in the pit muds from different parts of Luzhou Laojiao cellar with 50 years

圖2 50年窖齡窖池中窖泥中的揮發(fā)性組分及比例Fig.2 The composition and proportion of the volatile compounds in the pit muds from different parts of Luzhou Laojiao cellar with 50 years

己酸的主要產(chǎn)生途徑是在己酸菌與甲烷菌偶聯(lián)作用下，通過乙醇氧化生成乙酸，乙醇再進一步與丁酸作用生成己酸［15］。由窖壁窖泥中己酸的含量數(shù)據(jù)可直接推測，窖壁窖泥中含有大量的己酸菌與甲烷菌;而對于窖底窖泥，結合其酯類化合物中同樣存在大量己酸酯類化合物的分析結果，可以說明窖底窖泥中同樣存在大量的己酸菌與甲烷菌，但產(chǎn)生的己酸全部用于酯類化合物的生成，沒有過量積累。

2.2.3 酯類化合物

酯類化合物是窖泥中含量最高、種類最多的揮發(fā)性組分，是對白酒風味影響最大的主體物質(zhì)。其生成途徑主要有兩條，一是通過一些生香酵母(如漢遜酵母、假絲酵母等)體內(nèi)的酯化酶作用產(chǎn)生，二是通過緩慢的酯化反應而產(chǎn)生。50年窖齡的窖泥樣品中酯類化合物的相對含量占揮發(fā)性化合物總量的一半以上，說明窖泥中存在大量可進行酯化作用的微生物菌群［14］。

乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯以及已酸乙酯這“白酒四大酯”在窖泥樣品中均可檢測到，其中乳酸乙酯含量很低，在窖底窖泥中沒有檢測到。乙酸乙酯與己酸乙酯是窖壁窖泥與窖底窖泥的共同主體酯類，占酯類化合物總量的一半左右。

進一步比較窖壁窖泥與窖底窖泥中的酯類化合物發(fā)現(xiàn)，己酸酯種類最多，其中窖壁窖泥中有8種，窖底窖泥中有4種。此外，己酸酯的含量也存在顯著差異。窖壁窖泥中含有2.43%的己酸丁酯與8.40%的己酸己酯，分別是窖底窖泥中相應成分的18.7倍與15.8倍;而窖底窖泥中則含有大量的己酸甲酯，含量高達23.79%，是窖壁窖泥的22.7倍，與醇類化合物分析數(shù)據(jù)聯(lián)系起來可以推測，窖底窖泥中含有一定量的可水解利用果膠質(zhì)原料的微生物［16］，水解產(chǎn)生的甲醇與己酸酯化進而生成己酸甲酯。

2.2.4 醛酮類化合物

醛類化合物對濃香型酒的香氣起到一定的作用，但風味閾值低，含量過高容易造成苦味［17］。由分析結果可知，醛酮類化合物在窖泥中的含量較低，分別占窖壁窖泥與窖底窖泥中揮發(fā)性組分的4.09%與6.172%，主要是壬醛、癸醛、辛醛、2-戊酮等高級醛酮化合物。

2.2.5 酚類化合物

酚類化合物主要來自于蛋白質(zhì)、木質(zhì)素等的分解產(chǎn)物，含量很少，但呈香作用明顯，在含量極低的情況下，也能呈現(xiàn)出強烈的香味［14］。檢測到的酚類化合物有3種，包括苯酚、對甲基酚和2，4-二叔丁基苯酚，在窖壁窖泥與窖底窖泥中的含量差異較小。

3 結論

以瀘州老窖50年窖齡窖池為研究對象，采用HS-SPME與GC-MS聯(lián)用的方法，檢測窖壁窖泥與窖底窖泥中的揮發(fā)性物質(zhì)的組成，并進行差異分析。從窖池窖泥中共檢測出65種揮發(fā)性化合物，其中窖壁窖泥53種，窖底窖泥49種。這些揮發(fā)性組分主要是酯類、醇類、酸類、醛酮類及酚類化合物。窖壁窖泥與窖底窖泥中的醇類、醛酮類以及酚類化合物差異不大，而酸類與酯類化合物無論在種類還是數(shù)量上均存在顯著差異。

窖壁窖泥中檢測到以己酸為主成分的5種酸類化合物，而窖底窖泥中僅檢測到己酸的存在。窖壁窖泥中的己酸含量高達16.20%，是窖底窖泥中含量的19.0倍。酯類化合物是窖泥中含量最高、種類最多的揮發(fā)性組分，在窖壁窖泥與窖底窖泥中的相對含量分別達到51.58%和59.82%，其中，乙酸乙酯與己酸乙酯是窖壁窖泥與窖底窖泥的共同主體酯類;己酸酯的種類與含量存在顯著區(qū)別，窖壁窖泥中含有2.43%的己酸丁酯與8.40%的己酸己酯，分別是窖底窖泥中相應成分的18.7倍與15.8倍;而窖底窖泥中則含有23.79%己酸甲酯，是窖壁窖泥的22.7倍。

本研究建立了HS-SPME/GC-MS法用于檢測窖泥中揮發(fā)性組分的分析方法，分析了窖池中不同部位窖泥揮發(fā)性成分的差異以及對風味物質(zhì)形成的影響，為進一步理解白酒中風味物質(zhì)的形成機理，更好地揭示窖泥與風味的關聯(lián)提供參考。

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