梅鶯，黃慶德，鄧乾春，楊金娥，趙春

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北 武漢，430062)

亞麻籽中含α-亞麻酸和亞油酸等不飽和脂肪酸及木酚素等多種生物活性物質(zhì)，具有降血脂、降血糖［1］、抗氧化［2］、抗腫瘤［3］、提高免疫力［4］、增強(qiáng)肺組織對輻射的耐受性［5］和減肥［6］等多種功效。亞麻籽餅粕是亞麻籽榨油后副產(chǎn)物，富含蛋白質(zhì)和膳食纖維等營養(yǎng)成分，是優(yōu)質(zhì)的畜禽飼料和食品添加劑。然而，亞麻籽中含有生氰糖苷，限制了它的使用［7］。

目前亞麻籽脫毒的主要方法有水煮法、溶劑法、微波法、擠壓法、烘烤法和酶法等。水煮法［8］可明顯降低生氰糖苷含量，但會(huì)使亞麻籽中的生物活性物質(zhì)失去活性及營養(yǎng)物質(zhì)被破壞。擠壓法［9］具有物料作用時(shí)間短、營養(yǎng)損失小等優(yōu)點(diǎn)，但擠壓過程會(huì)造成油脂浪費(fèi)。微波法［10］能顯著降低亞麻籽粕中生氰糖苷含量，但很難實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。溶劑脫毒法［11］可顯著降低亞麻籽中生氰糖苷含量，工藝簡單，但存在溶劑殘留等食品安全風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)合成本與設(shè)備條件，以及脫毒后產(chǎn)品的用途，本實(shí)驗(yàn)采用微生物發(fā)酵法對亞麻餅粕中的生氰糖苷進(jìn)行降解，微生物在自身代謝過程中可以產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，可以降解生氰糖苷，同時(shí)該法具有安全高效，條件溫和和成本低的優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

冷榨亞麻餅粕:實(shí)驗(yàn)室自制。

菌株:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，CICC 31077)，枯草芽孢桿菌(Bacillus sublitis，ACCC01183)，米 曲 霉 (Aspergillusoryzae)［12］，黑 曲 霉 (Aspergillusniger)［12］。

培養(yǎng)基:酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨酵母膏培養(yǎng)基，土豆培養(yǎng)基，麥芽汁培養(yǎng)基。

NaOH，NH3·H2O，KI，AgNO3，Pb(NO3)2等均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

微型植物粉碎機(jī)FZ102型，天津市美斯特儀器有限公司;凱氏定氮儀，上海精隆科學(xué)儀器有限公司;MiLLi-Q純水處理系統(tǒng)，美國MiLLipoer公司;電子天平，瑞士METTLER TOLEDO。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生氰糖苷的定量［13－14］

稱取8 g試樣于凱氏燒瓶中，加水約150 mL，塞嚴(yán)瓶口，在室溫下放置2～4 h后，迅速連接到凱氏定氮儀，使冷凝管下端浸入盛有20 mL NaOH溶液的錐形瓶的液面下，通水蒸氣進(jìn)行蒸餾，收集蒸餾液150 mL，取下錐形瓶，加入10 mL Pb(NO3)2液，混勻，靜置15 min，過濾于250 mL容量瓶中。準(zhǔn)確移取100 mL上述濾液，置另一錐形瓶中，加入8 mL NH3·H2O和2 mL KI溶液，混勻，在黑色背景襯托下，用微量滴定管以AgNO3標(biāo)準(zhǔn)滴定液［15］滴定至出現(xiàn)混濁時(shí)為終點(diǎn)，記錄消耗體積。在和試樣測定相同的條件下，做試劑空白試驗(yàn)，記錄消耗體積。

其中:c，AgNO3的濃度(mol/mL);V，樣品消耗AgNO3的體積(mL);V0，空白消耗 AgNO3的體積(mL)。

1.3.2 氫氰酸脫除率的測定

分別以1.3.1法測定發(fā)酵前原料的HCN含量為A，發(fā)酵后后樣品HCN含量為B，計(jì)算HCN脫除率:

1.3.3 微生物的選擇

把20 g亞麻餅粕粉碎，按50%的含水量和3%的接種量接入釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、米曲霉和黑曲霉，攪拌均勻，適宜溫度下培養(yǎng)72 h后按1.3.1的方法測生氰糖苷的含量。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

分別以發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、含水量為單因素進(jìn)行試驗(yàn)，考察各單因素對生氰糖苷降解的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物的選擇

選用釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、米曲霉和黑曲霉對亞麻餅粕進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后生氰糖苷脫除率和未經(jīng)發(fā)酵的亞麻餅粕比較見表1。

表1 不同微生物對生氰糖苷降解效果影響Table 1 Different processing methods effecting on HCN contentofflaxseed meal

2.2 釀酒酵母發(fā)酵單因素試驗(yàn)

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對生氰糖苷脫除率的影響

準(zhǔn)確稱取20 g亞麻粕，在4%的接種量，50%的含水量，發(fā)酵溫度28℃的條件下考察發(fā)酵時(shí)間對生氰糖苷脫除率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對生氰糖苷脫除率的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the degradability of CGs

生氰糖苷的脫除率隨發(fā)酵時(shí)間的增加而增大，當(dāng)發(fā)酵72 h時(shí)增長緩慢?？赡茈S著時(shí)間的的增長，微生物對生氰糖苷的降解已經(jīng)達(dá)到臨界值，考慮生產(chǎn)成本問題，發(fā)酵時(shí)間選72 h為宜。

2.2.2 接種量對生氰糖苷脫除率的影響

準(zhǔn)確稱取20 g亞麻粕，在50%含水量，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵72 h的條件下，接種量分別為2%、3%、4%、5%，6%，考察接種量對生氰糖苷脫除率的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)接種量為4%時(shí)，生氰糖苷的脫除率達(dá)到最大值。當(dāng)接種量繼續(xù)增加，生氰糖苷脫除率有所降低，可能接種量過高，不利于釀酒酵母的生長，影響β-葡萄糖苷酶的活性，故接種量選4%為宜。

圖2 接種量對生氰糖苷脫除率的影響Fig.2 Effect of inoculation size on the degradability of CGs

2.2.3 含水量對生氰糖苷脫除率的影響

準(zhǔn)確稱取20 g亞麻粕，在4%接種量，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵72 h的條件下，含水量分別為40%、45%、50%、55%、60%，考察含水量對生氰糖苷脫除率的影響，結(jié)果如圖3所示。生氰糖苷的脫除率隨著含水量的上升而增加，50%達(dá)到最大值。高于50%，脫除率下降。在含水量為45% ～55%發(fā)酵，菌體能夠很好的生長，利于生氰糖苷的降解。因此，含水量選50%為宜。

圖3 含水量對生氰糖苷脫除率的影響Fig.3 Effect of moisture content on the degradability of CGs

2.2.4 發(fā)酵溫度對生氰糖苷脫除率的影響

準(zhǔn)確稱取20 g亞麻粕，在4%的接種量，50%的含水量，發(fā)酵72 h的條件下，發(fā)酵溫度分別為20、24、28、32、36℃，考察發(fā)酵溫度對生氰糖苷脫除率的影響，結(jié)果如圖4所示。生氰糖苷脫除率隨著發(fā)酵溫度的上升而增加，28℃達(dá)到最大值。高于32℃，SDG提取率下降。在24～32℃，菌體能夠很好的生長，利于SDG的釋放。因此，發(fā)酵溫度選28℃為宜。

圖4 發(fā)酵溫度對生氰糖苷脫除率的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the degradability of CGs

2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定以發(fā)酵時(shí)間，接種量，含水量和發(fā)酵溫度4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表2所示。選用L9(34)正交進(jìn)行正交試驗(yàn)，對結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，如表3所示。

表2 正交試驗(yàn)表Table 2 Table of orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)方差分析表Table 3 Analysis of variance table of orthogonal test

由表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，生氰糖苷微生物降解的最佳發(fā)酵條件為:A2B1C2D2。各種因素對脫除率影響的主次順序?yàn)?發(fā)酵時(shí)間(A)＞發(fā)酵溫度(D)＞接種量(B)＞含水量(C)。通過方差分析檢驗(yàn)可知，發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵溫度和接種量的影響較為顯著。優(yōu)化得到釀酒酵母發(fā)酵最佳條件為接種量為3%，含水量為50%，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間72 h。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)確定的提取條件，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，生氰糖苷的脫除率為76.91%，高于表2中各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，表明正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)組合是符合實(shí)際的。故接種量為3%，含水量為50%，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間72 h為最佳發(fā)酵條件。

3 結(jié)論

(1)實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選得出微生物發(fā)酵降解的最佳菌株為釀酒酵母，發(fā)酵條件:接種量為3%，含水量為50%，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間72 h。

(2)在優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測得生氰糖苷的脫除率為76.91%，高于正交試驗(yàn)中較優(yōu)組的脫除率，表明此正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)組合是符合實(shí)際的。

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