劉會省，遲海，楊憲時，李學(xué)英，王妤

1(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093)2(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海，200090)

南極磷蝦是生活在南大洋的一種甲殼類浮游動物，其巨大的捕撈量占現(xiàn)有世界漁業(yè)產(chǎn)量的一半，被譽為是最有希望的動物蛋白庫［1］。同時，南極磷蝦的營養(yǎng)價值較高，不飽和脂肪酸含量豐富，氨基酸種類齊全，VA和 VE含量極高［2－3］，研究顯示其蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值明顯高于牛奶中的蛋白質(zhì)［4］。因此，開發(fā)和利用南極磷蝦資源具有重大的意義。

值得注意的是，由于南極水域距離和加工技術(shù)問題，南極磷蝦大多經(jīng)過捕撈后船上低溫凍結(jié)，運輸至指定位置進行加工。南極磷蝦體內(nèi)酶活高，極易自溶，因此盡可能地在低溫條件下冷凍加工南極磷蝦對其品質(zhì)保持起決定作用。目前相關(guān)研究對凍藏溫度和冷藏溫度條件下南極磷蝦品質(zhì)變化進行了報道［5］，但凍結(jié)溫度對南極磷蝦品質(zhì)影響的研究未見報道。本試驗選取了5種不同的凍結(jié)溫度，以感官、質(zhì)構(gòu)、持水力、鹽溶性蛋白質(zhì)、Ca2+-ATP酶活性和組織切片變化為指標(biāo)，對不同凍結(jié)溫度條件下南極磷蝦的品質(zhì)變化進行研究，旨在為南極磷蝦的冷凍加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

南極磷蝦由我國“南極海洋生物資源開發(fā)利用項目組”于2012年6月5號南極FAO 48.1區(qū)捕撈，船上凍結(jié)后 －22℃凍藏，在 －18℃冷凍條件下于2012年9月13號運抵實驗室，在－80℃凍藏備用。

1.2 試驗試劑與儀器

主要試劑:牛血清蛋白購于北京索萊寶科技有限公司;考馬斯亮藍 G－250、濃磷酸、無水乙醇等購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器:均質(zhì)機IUL型，西班牙;高速冷凍離心機5810R型，Eppendorf，德國;721型可見光分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司;質(zhì)構(gòu)儀TMS-Pro型，F(xiàn)ood Technology Corporation，美國;RC-DT618B型雙溫度記錄儀，杭州哈泰克科技有限公司;175－T2型溫度記錄儀，Testo，德國;MPR－414F型冰箱，Sanyo，日本;BX51型顯微鏡，Olympus，日本;HM315輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機，Microm，德國。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理方法

［1］方法，將樣品進行流水解凍。為了快速降低樣品溫度并控制初始溫度，解凍完全后，用濾網(wǎng)將樣品在冰水中浸泡30 s，瀝干水后放在凍結(jié)盤里在不同凍結(jié)溫度下進行凍結(jié)，凍結(jié)盤規(guī)格24 cm×16 cm×6 cm(長×寬×高)，質(zhì)量約2.0 kg，用熱電偶監(jiān)測樣品表面及中心的溫度變化，待樣品中心溫度降至－18℃時即為凍結(jié)終點，并記錄時間。將凍結(jié)結(jié)束的樣品解凍，解凍完全后進行相關(guān)指標(biāo)的測定。同時使用第一次解凍完全后的樣品作為對照組。

1.3.2 凍結(jié)速率測定

按照國際制冷協(xié)會提出的食品凍結(jié)速率的定義［6］，根據(jù)下式進行凍結(jié)速率的計算:

式中:L為食品表面與熱中心的最短距離，cm;t為食品表面達0℃至熱中心達初始凍結(jié)溫度以下10℃所用的時間，h。

1.3.3 感官檢驗

按照參考文獻［5］選擇經(jīng)過訓(xùn)練的評價員7名，依據(jù)表1的評分標(biāo)準(zhǔn)，以南極磷蝦的體表、色澤、肌肉及90℃水煮5 min的氣味和湯汁為評價指標(biāo)，各項指標(biāo)滿分2分，最好品質(zhì)為10分，最差品質(zhì)為0分。

表1 南極磷蝦感官檢驗評分規(guī)則Table 1 Rules of sensory evaluation on Antarctic krill

1.3.4 鹽溶性蛋白質(zhì)測定

參考Pan等［7］的方法提取樣品中的鹽溶性蛋白質(zhì)，結(jié)合考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，用牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，595 nm條件下測定南極磷蝦鹽溶性蛋白質(zhì)含量［8］(標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.005 8x+0.011 5，R2=0.996 3)，計算結(jié)果以mg/g表示。

1.3.5 持水力測定

參考Robertson等［9］的方法，將30 g的樣品打漿后11 000 r/min離心40 min，除去上清液后稱量樣品質(zhì)量。

式中:m0為離心前樣品的質(zhì)量，g;m為樣品離心后除去上清液的質(zhì)量，g。

1.3.6 Ca2+-ATP酶活性測定

Ca2+-ATP酶活性測定參考超微量ATP酶測試盒(南京建成生物技術(shù)研究所提供)說明書進行。

Ca2+-ATP酶活降低率/%=［(凍結(jié)前活性－凍結(jié)后活性)/凍結(jié)前活性］×100

1.3.7 剪切力測定

本試驗用TMS-Pro型質(zhì)構(gòu)儀檢測樣品的最大剪切力，采用燕尾剪切探頭對樣品進行剪切，測試速度:60 mm/min;回程距離:20 mm;最大力量感應(yīng)量程:1 000 N，測定樣本數(shù)n=10。

1.3.8 石蠟切片觀察

用Bouin氏固定液對樣品組織進行固定，參考文獻［10］，采用石蠟包埋法對樣品進行處理。用蘇木精和伊紅對組織切片進行染色，顯微鏡觀察。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 凍結(jié)溫度對凍結(jié)曲線、凍結(jié)速率的影響

南極磷蝦在不同凍結(jié)溫度下的凍結(jié)速率見表2。隨著凍結(jié)溫度的降低，凍結(jié)速率逐漸增大。根據(jù)國際制冷協(xié)會對快速凍結(jié)的定義［11］，南極磷蝦在－40℃和－50℃的凍結(jié)為快速凍結(jié)，而在－18、－23℃和－28℃的凍結(jié)為慢速凍結(jié)，有研究認為快速凍結(jié)更有利于保持凍品的凍結(jié)質(zhì)量［12］。

表2 不同凍結(jié)溫度下的凍結(jié)速率和凍結(jié)時間Table 2 Freezing ratesand time under different freezing temperature

圖1 不同凍結(jié)溫度條件下的凍結(jié)曲線Fig.1 Freezing curves under different freezing temperature

圖1是在不同凍結(jié)溫度下南極磷蝦中心溫度的變化。如圖1所示，－18℃下南極磷蝦凍結(jié)完成時間最長達31.8 h，隨著凍結(jié)溫度降低，凍結(jié)完成的時間明顯縮短，通過最大冰晶生成帶時間的減少，－28℃凍結(jié)條件下的凍結(jié)完成時間為18.0 h，而快速凍結(jié)條件下樣品凍結(jié)結(jié)束的時間不超過6.0 h。南極磷蝦通過最大冰晶生成帶時，組織內(nèi)部會有水分的轉(zhuǎn)移，時間越長內(nèi)部水分轉(zhuǎn)移越明顯，使得產(chǎn)生的冰晶變大且分布不均勻，從而引起南極磷蝦的品質(zhì)變化。目前，國內(nèi)外有關(guān)凍結(jié)溫度對南極磷蝦品質(zhì)的影響研究較少，而對其他肉類的研究比較多。相關(guān)研究表明，降低凍結(jié)溫度或提高凍結(jié)速率可以減少對凍品品質(zhì)的影響［13－14］。

2.2 凍結(jié)溫度對感官評分的影響

南極磷蝦在不同凍結(jié)溫度下的感官評分如圖2。在－18℃凍結(jié)后，南極磷蝦色澤變暗，有較淡的腥味，湯汁稍混，少量樣品出現(xiàn)黑頭，感官評分6.1，隨著凍結(jié)溫度的降低南極磷蝦的感官評分升高，在－23℃和－28℃凍結(jié)下南極磷蝦的感官評分差別不明顯，－40、－50℃凍結(jié)后的樣品感官評分分別達8.8和9.1，說明快速凍結(jié)對南極磷蝦的感官影響較小。這是由于在較低的凍結(jié)溫度下南極磷蝦體內(nèi)的酶活降低，自溶和黑變減緩，同時凍結(jié)時間縮短，降低了南極磷蝦自溶和黑變的時間。

圖2 凍結(jié)溫度對南極磷蝦感官評分的影響Fig.2 Effect of freezing temperature onsensory evaluation of Euphau siasuperba

2.3 凍結(jié)溫度對持水力的影響

圖3是南極磷蝦在不同凍結(jié)溫度下的持水力變化。肌肉中的水大部分位于肌原纖維中由粗、細絲組成的三維網(wǎng)絡(luò)里，在一定條件下這些三維網(wǎng)絡(luò)可收縮和膨脹，被其包裹著的水也會隨之增減。圖3是南極磷蝦在不同凍結(jié)溫度下的持水力變化，在－18℃下的持水力最小，隨著凍結(jié)溫度的降低，持水力增強，－40、－50℃凍結(jié)條件下的持水力較大，南極磷蝦在凍結(jié)過程中產(chǎn)生的冰晶對肌原纖維造成機械損傷，從而使肌原纖維包裹的水分減少，持水力下降［15］，而在快速凍結(jié)條件下，南極磷蝦的肌肉牢固束縛其自身和外加水的能力可以得到保持，這與牛力等［16］的研究結(jié)果相近。

2.4 凍結(jié)溫度對鹽溶性蛋白質(zhì)的影響

圖4是南極磷蝦中鹽溶性蛋白質(zhì)在凍結(jié)前后的含量變化，在－18℃凍結(jié)條件下鹽溶性蛋白質(zhì)的含量為26.81 mg/g，與對照組45.63 mg/g相比下降了41.24%，差異極顯著(P＜0.01)，鹽溶性蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重。－23、－28℃凍結(jié)條件下分別為31.70、33.59 mg/g，無明顯差異(P＞0.05)，－40℃和－50℃凍結(jié)下的南極磷蝦的鹽溶性蛋白質(zhì)含量分別為41.70 mg/g和43.59 mg/g，可見快速凍結(jié)條件下的鹽溶性蛋白質(zhì)的含量明顯高于慢速凍結(jié)，這與關(guān)志強等［17］對文蛤蛋白質(zhì)冷凍變性的研究結(jié)果一致，這可能是由于在凍結(jié)過程中肌細胞外產(chǎn)生冰晶，使得肌細胞內(nèi)肌原纖維被擠壓集結(jié)成束，同時冰晶形成時蛋白質(zhì)失去結(jié)合水，導(dǎo)致蛋白質(zhì)反應(yīng)基互相結(jié)合形成各種交聯(lián)而變性。

圖3 凍結(jié)溫度對南極磷蝦持水力的影響Fig.3 Effect of freezing temperature onWHC of Euphausia superba

圖4 凍結(jié)溫度對南極磷蝦鹽溶性蛋白質(zhì)的影響Fig.4 Effect of freezing temperature on salt-soluble protein of Euphausia superba

2.5 凍結(jié)溫度對Ca2+-ATP酶活性的影響

圖5是不同凍結(jié)溫度下南極磷蝦Ca2+-ATP酶活性的變化。經(jīng)過不同溫度凍結(jié)之后，南極磷蝦Ca2+-ATP酶活性有不同程度的下降。在－18℃凍結(jié)時南極磷蝦的Ca2+-ATP酶活性下降了27.42%，變性程度較其他溫度條件下高。而－50℃的凍結(jié)溫度條件下變性最小，在 －23℃和 －28℃凍結(jié)條件下的Ca2+-ATP酶活性無明顯差異(P＞0.05)，這可能是由于這二種溫度之間溫差較小。經(jīng)過不同的溫度凍結(jié)之后南極磷蝦的Ca2+-ATP酶活性下降說明南極磷蝦蛋白在凍藏過程中發(fā)生了變性，而下降幅度比鹽溶性蛋白下降幅度小說明肌球蛋白桿部比肌球蛋白頭部更容易發(fā)生變性。

圖5 凍結(jié)溫度對南極磷蝦Ca2+-ATP酶活性的影響Fig.5 Effect of freezing temperature onCa2+-AT Pase activity of Euphausia superba

2.6 凍結(jié)溫度對南極磷蝦質(zhì)構(gòu)的影響

不同凍結(jié)溫度下南極磷蝦最大剪切力的變化如圖6所示。由于南極磷蝦個體比較小，肌肉組織柔軟，蝦殼較薄致使其最大剪切力較小。對照組的最大剪切力為2.69 N，該結(jié)果與楊峰等［18］對南極磷蝦的最大剪切力的測定值相近。樣品在－18℃凍結(jié)條件下，最大剪切力值最小，－23、－28℃凍結(jié)后的最大剪切力值為2.09、2.34 N，與對照組之間均存在顯著性差異，－50℃凍結(jié)條件下的最大剪切力值較大，－40℃和－50℃凍結(jié)條件下的測定值無明顯差異(P＞0.05)。南極磷蝦的最大剪切力隨著凍結(jié)溫度的降低而增大，這與盧燕等［19］對其他肉類凍結(jié)品質(zhì)變化的研究結(jié)果相一致，進一步證明不同凍結(jié)溫度下產(chǎn)生的冰晶對肌肉組織的破壞程度不同，快速凍結(jié)對凍品的肌肉組織破壞程度較小。

圖6 凍結(jié)溫度對南極磷蝦剪切力的影響Fig.6 Effect of freezing temperature oncutting forceof Euphausia superba

2.7 凍結(jié)溫度對肌肉組織的影響

肌肉組織中存在著自由水和結(jié)合水，在凍結(jié)過程中，水分不斷結(jié)成冰使得水分轉(zhuǎn)移，由于凍結(jié)溫度和凍結(jié)速率的不同，冰晶的大小和分布不同。凍結(jié)溫度越低，凍結(jié)速率越大，凍結(jié)過程中產(chǎn)生的冰晶小且分布均勻，則對組織的損傷小。圖7是南極磷蝦在不同凍結(jié)溫度下的組織切片，在－18℃凍結(jié)條件下，凍結(jié)速率慢，凍結(jié)時間長，產(chǎn)生的冰晶大且分布不均勻使得肌肉組織之間間隙較大，并且可以看到明顯的斷裂痕跡，肌肉組織損傷嚴(yán)重。在－23、－28℃凍結(jié)下，南極磷蝦的肌肉組織與對照組相比肌肉間隙明顯，纖維條紋粗大，但是彼此間的肌肉組織間隙差別不明顯，這可能是由于凍結(jié)時間和通過最大冰晶生成帶的時間相近，也可能是持水力差別不明顯和最大剪切力差異不顯著的原因。樣品經(jīng)過－40℃和－50℃凍結(jié)后，肌肉組織纖維條紋較細、組織間隙小，說明快速凍結(jié)比慢速凍結(jié)更有利于南極磷蝦品質(zhì)的保持，－40、－50℃凍結(jié)后肌肉組織間隙差別不大。李敏等［20］研究了凍結(jié)方式對文蛤肌肉結(jié)構(gòu)的影響后發(fā)現(xiàn)，在小范圍內(nèi)提高冷凍速度對凍品品質(zhì)的改善不明顯。余小領(lǐng)等［21］對不同凍結(jié)速率下豬肉超微結(jié)構(gòu)進行觀察后認為，樣品經(jīng)過凍結(jié)后，肌肉組織都會受到不同程度的損傷，隨著凍結(jié)溫度的降低凍結(jié)產(chǎn)生的損傷減小;Sanz等［22］的研究結(jié)果顯示，提高凍結(jié)速率可以有效地減少冰晶對組織結(jié)構(gòu)的損傷。本研究結(jié)果證實了上述結(jié)論。

3 結(jié)論

(1)南極磷蝦在－40℃和－50℃的凍結(jié)為快速凍結(jié)，在－18、－23℃和－28℃的凍結(jié)為慢速凍結(jié)。

(2)凍結(jié)導(dǎo)致南極磷蝦的感官評分和持水力降低，凍結(jié)溫度越低，感官評分和持水力越高。

(3)南極磷蝦經(jīng)過不同溫度凍結(jié)后，鹽溶性蛋白質(zhì)含量下降，在－18℃凍結(jié)條件下與對照組相比下降了41.24%且差異極顯著(P＜0.01)，－50℃下鹽溶性蛋白質(zhì)含量與對照組無明顯差異(P＞0.05)，快速凍結(jié)條件下的鹽溶性蛋白質(zhì)的含量明顯高于慢速凍結(jié)。

(4)凍結(jié)對南極磷蝦的Ca2+-ATP酶的活性有一定的影響，凍結(jié)溫度降低，則酶活升高，快速凍結(jié)對南極磷蝦的Ca2+-ATP酶的活性影響較小。

(5)與對照組相比，經(jīng)過不同溫度凍結(jié)后南極磷蝦的最大剪切力都有所下降，但是－50℃下與對照組差異不明顯(P＜0.05)。

(6)通過組織切片的觀察，經(jīng)過慢速凍結(jié)后的南極磷蝦與對照組相比組織間隙明顯、肌纖維粗大，尤其在－18℃凍結(jié)條件下的肌肉組織有明顯斷裂的現(xiàn)象，而－40、－50℃凍結(jié)條件下的南極磷蝦的肌肉損傷較小。

圖7 不同溫度條件下的組織切片F(xiàn)ig.7 Tissue section of Euphausia superba under different freezing temperature

本研究結(jié)果證明，快速凍結(jié)有利于南極磷蝦品質(zhì)的保持。由于在－40℃和－50℃凍結(jié)下的南極磷蝦的各項質(zhì)量指標(biāo)差別不明顯，綜合考慮節(jié)能等問題，南極磷蝦的最佳凍結(jié)溫度確定為－40℃。

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