劉錦繡，陳偉，李靖，程芳

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安，271018)

豆豉是我國(guó)傳統(tǒng)大豆發(fā)酵制品，有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有豆豉纖溶酶、大豆異黃酮、大豆低聚糖、大豆皂苷等多種功能因子，此外還含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸［1］。

大豆異黃酮被稱為“健康促進(jìn)劑”［2］，適當(dāng)?shù)財(cái)z入能減少患乳腺癌、結(jié)腸癌、冠心病等的發(fā)病幾率［3］。研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮對(duì)癌細(xì)胞株有體外抗腫瘤作用，是一種潛在的抗腫瘤預(yù)防劑［4－5］。目前，普遍認(rèn)為單獨(dú)服用異黃酮或配合化療可能是一種有效的抗癌方法［6－7］。大豆異黃酮分為游離型苷元和結(jié)合型糖苷兩大類。β-葡萄糖苷酶可以水解糖苷型異黃酮，使其轉(zhuǎn)化為苷元型異黃酮，更好發(fā)揮異黃酮的藥理活性并提高豆豉的抗腫瘤能力［8］。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)豆豉抗腫瘤功能有所研究，但是對(duì)混菌發(fā)酵提高豆豉抗腫瘤能力的研究還不多見(jiàn)。本試驗(yàn)從自然發(fā)酵的細(xì)菌型豆豉中篩選出高產(chǎn)蛋白酶的菌株(D2)［9］和產(chǎn) β-葡萄糖苷酶的菌株(U35)，在單菌發(fā)酵的基礎(chǔ)上，進(jìn)行混菌發(fā)酵，研究單菌、混菌豆豉提取物對(duì)抗腫瘤增殖的影響，并深入探討混菌豆豉異黃酮各組分含量與豆豉抗腫瘤作用的關(guān)系，以期將豆豉開(kāi)發(fā)成為新一代功能性食品。

1 材料與方法

1.1 材料

LLC細(xì)胞株:小鼠肺癌細(xì)胞株，由中科院細(xì)胞庫(kù)提供;枯草芽孢桿菌D2:蛋白酶產(chǎn)生菌，實(shí)驗(yàn)室篩選;枯草芽孢桿菌U35:β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌，實(shí)驗(yàn)室篩選;MTT:美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品;DMEM培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清:美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO):北京化工廠產(chǎn)品。

1.2 主要儀器

SW-CL-LF凈化工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn);CO2孵化箱，日本SANYO公司產(chǎn)品;PL-2002電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;SUNRISE酶標(biāo)儀，TECAN公司產(chǎn)品;96孔培養(yǎng)板，美國(guó)eorning公司;高效液相色譜儀(包括LC－10AT泵、SPD－10A檢測(cè)器、SCL－10A控制器、CTO－10AS柱溫箱)，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 豆豉生產(chǎn)工藝及要點(diǎn)

豆豉:黑豆→篩選→浸泡(3倍的水，35℃浸泡16 h)→蒸煮(121℃，35 min)→冷卻至室溫→接種(接種量2%)→恒溫制曲(37℃下發(fā)酵72 h，每6 h翻曲1次)→配制(食鹽、老姜、花椒等)→入壇發(fā)酵→成品豆豉

混菌豆豉:接種(接種比例 D2∶U35=1∶1，接種量2%)，其余同豆豉生產(chǎn)。

1.3.2 異黃酮提取物的制備及含量檢測(cè)

其中：是狀態(tài)向量；是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的量測(cè)輸出；是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的估計(jì)輸出；是干擾輸入；；是連接權(quán)矩陣；是具有適當(dāng)維數(shù)的常數(shù)矩陣；是常數(shù)輸入；是初始條件，變時(shí)滯滿足，是已知常數(shù)；是神經(jīng)元的激活函數(shù)，滿足

豆豉→干燥→粉碎→過(guò)60目篩→稱取粉末100 g→石油醚脫脂→60%乙醇超聲提取2 h(重復(fù)3次)，料液比1∶20(g∶mL)→過(guò)濾→合并濾液→濃縮→異黃酮提取物［10］

色譜條件［11］:

色譜柱:Alltima C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-乙酸-水(45∶0.5∶55);流速:1.0 mL/min;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:2 0 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm。

1.3.3 LLC細(xì)胞的體外培養(yǎng)

將LLC的貼壁細(xì)胞接種在含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中吹打混勻后置于37℃、5%CO2孵化箱中培養(yǎng)、傳代。每日用倒置顯微鏡檢查細(xì)胞，如發(fā)現(xiàn)污染或細(xì)胞破碎，必須丟棄。

1.3.4 染料排斥法測(cè)定豆豉異黃酮提取物的抗腫瘤作用

調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×104/mL，取50 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組3個(gè)平行孔，置于37℃、5%孵化箱中培養(yǎng)24 h。將消毒處理過(guò)的豆豉異黃酮提取物用無(wú)水乙醇溶解，配制 100，30，10，3，1 μg/mL 溶液分別加到不同孔中。每孔加入豆豉異黃酮提取液50 μL，置于37℃、5%CO2孵化箱中培養(yǎng)72 h。

培養(yǎng)72h后混勻，加 Hoechst溶液33342染液0.5 mL，0.9%生理鹽水0.3 mL，混勻，室溫下放置10 min。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)及死細(xì)胞數(shù)［12］。

1.3.5 MTT法測(cè)定豆豉提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用

調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×104/mL，取100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組3個(gè)平行孔，置于37℃、5%孵化箱中培養(yǎng)24 h。將消毒處理過(guò)的豆豉異黃酮提取物用無(wú)水乙醇溶解，在孔中分別加入濃度為100，10，1，0.1，0.01 μg/mL 豆豉異黃酮提取液 10 μL。對(duì)照孔中加入10 μL無(wú)水乙醇。置于37℃、5%CO2孵化箱中培養(yǎng)72 h。MTT用無(wú)血清IMDM培養(yǎng)液配成1mg/mL 溶液，每孔中加入 50 μL，置于 37℃、5%CO2孵化箱中培養(yǎng)4h。吸出上清液，加入100 μL DMSO，用搖床搖勻。測(cè)定吸光度(OD570值)［13－14］。

1.3.6 MTT法測(cè)定對(duì)LLC細(xì)胞增殖的抑制作用

試驗(yàn)分為豆豉組、溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組，其中豆豉組異黃酮提取物各劑量組分別為20，40，60，80，100，120，140 和160 μg/mL;溶劑對(duì)照組加入終濃度加0.1%的DMSO;空白對(duì)照組僅加入等體積培養(yǎng)液，不加藥物和細(xì)胞。

選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LLC細(xì)胞，經(jīng)0.25%(g/v)胰蛋白酶消化，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，預(yù)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后吸出全部上清，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度的各種受試物(總體積200 μL/孔)，每組3個(gè)平行。分別培養(yǎng)72 h和96 h，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 200 μL，平板搖床搖震10 min，以DMSO調(diào)零，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀以490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光值(A)，計(jì)算平均A值和增殖率及抑制率［13－15］。

運(yùn)用曲線回歸分析，求出劑量反應(yīng)關(guān)系方程及回歸系數(shù)。

1.4 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化

將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，預(yù)培養(yǎng)24h，溶劑對(duì)照組(0.1%DMSO)和實(shí)驗(yàn)組豆豉異黃酮提取物(100 μg/mL)培養(yǎng) 24、48、72 和 96h，Hoechst33342 染色后倒置熒光顯微鏡下觀察［16］。

1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果及圖形均采用Microsoft ExceL 2003軟件進(jìn)行處理、制作，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。數(shù)據(jù)分析采用SAS v9.0軟件，異黃酮含量對(duì)LLC細(xì)胞抑制的影響采用逐步回歸分析［17］(SRA，stepwise regression analysis)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆豉提取物異黃酮各組分含量的測(cè)定結(jié)果

不同豆豉的糖苷型異黃酮、苷元型異黃酮含量的差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05)(圖1)。D2、U35單菌豆豉和D2U35混菌豆豉的異黃酮總含量基本相同，D2U35混菌豆豉的苷元型異黃酮含量比D2單菌豆豉高 101.95 μg/mL，比 U35 單菌豆豉高 35.48 μg/mL。說(shuō)明混菌發(fā)酵提高了苷元型異黃酮含量。

圖1 不同豆豉提取物異黃酮各組分的含量Fig.1 Isoflavones content of each component in different groups

2.2 豆豉異黃酮提取物對(duì)LLC細(xì)胞的體外抑瘤作用

利用染料排斥法測(cè)定豆豉異黃酮提取物的抗腫瘤作用，LLC細(xì)胞株的活細(xì)胞率見(jiàn)表1。在LLC細(xì)胞中接入不同濃度的異黃酮提取物，隨著濃度的升高，LLC細(xì)胞存活率不斷下降。當(dāng)異黃酮提取物濃度為100 μg/mL時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制能力最強(qiáng)，D2、U35單菌豆豉的活細(xì)胞率分別比D2U35混菌豆豉高約6.99和4.12%。說(shuō)明D2U35混菌豆豉的抗腫瘤能力分別比D2、U35單菌豆豉高約6.99%和4.12%。

表1 LLC細(xì)胞株的活細(xì)胞率Table 1 LLC living cells rate

2.3 MTT法測(cè)定豆豉異黃酮提取物對(duì)LLC細(xì)胞的體外殺傷作用

豆豉異黃酮提取物溶液作用于LLC細(xì)胞72h后，各劑量孔的吸光度(OD570值)見(jiàn)表2。隨著豆豉異黃酮提取物濃度的升高，A值逐漸減小，說(shuō)明異黃酮提取物濃度越高對(duì)LLC細(xì)胞殺傷作用增大。當(dāng)異黃酮提取物濃度升高到 10 μg/mL、100 μg/mL 時(shí)，D2、U35、D2U35豆豉對(duì)LLC細(xì)胞殺傷作用出現(xiàn)明顯差別。D2U35混菌豆豉對(duì)LLC細(xì)胞殺傷最大，分別比D2、U35單菌豆豉高約27.75%和12.14%。

表2 豆豉異黃酮提取物對(duì)LLC細(xì)胞的體外殺傷作用Table 2 Inhibition of isoflavones on LLC in vitro

2.4 MTT法檢測(cè)豆豉異黃酮提取物對(duì)LLC細(xì)胞抑制的影響

圖2、圖3中，控制豆豉提取物濃度和作用時(shí)間，豆豉提取物作用于LLC細(xì)胞72 h、96 h后，隨劑量的增加、時(shí)間的延長(zhǎng)，LLC細(xì)胞抑制率提高，表明LLC細(xì)胞的抑制活性提高。當(dāng)濃度到達(dá)100 μg/mL時(shí)，隨著濃度增加，抑制率變化緩慢。D2U35混菌豆豉對(duì)腫瘤的抑制率最高，分別比D2、U35單菌豆豉高15.79%和7.02%，說(shuō)明D2U35混菌豆豉的抗腫瘤能力最高，其次是U35單菌豆豉，再次是D2單菌豆豉。

圖2 異黃酮提取物作用LLC細(xì)胞72 h的抑制率Fig 2 The effects of isoflavones on inhibitory rate in 72 h

圖3 異黃酮提取物作用LLC細(xì)胞96h的抑制率Fig 3 The effects of isoflavones on inhibitory rate in 96 h

利用數(shù)學(xué)分析法分析了豆豉總異黃酮含量、糖苷型異黃酮含量和苷元型異黃酮含量對(duì)LLC細(xì)胞抑制的影響。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)得出回歸方程為Y=12.670 7+0.181 9n+0.255 5k，(n為總異黃酮含量，P＜0.001;k為苷元型異黃酮含量，P＜0.001)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，R2=0.953 4，F(xiàn)=214.62。結(jié)果表明異黃酮各組分含量與LLC細(xì)胞增殖率成正相關(guān)，苷元苷型異黃酮含量對(duì)LLC細(xì)胞抑制影響較大，其次是總異黃酮含量。糖苷型異黃酮含量未被引入模型中，表明糖苷型異黃酮對(duì)LLC細(xì)胞的抑制影響較弱。

2.5 豆豉異黃酮提取物作用于LLC細(xì)胞的劑量反應(yīng)關(guān)系、時(shí)間反應(yīng)關(guān)系

對(duì)豆豉異黃酮提取物作用劑量分別與抑制率進(jìn)行曲線回歸分析，獲得回歸方程，豆豉提取物作用劑量與抑制率的曲線回歸分析結(jié)果:D2豆豉72 h，y=12.865x0.649，R2=0.996 1;D2 豆 豉 96 h，y=19.081x0.5731，R2=0.982 2。U35 豆豉 72 h，y=14.75x0.6669，R2=0.976 1;U35 豆 豉 96h，y=22.294x0.5399，R2=0.973 9。D2U35 豆豉 72 h，y=16.703x0.6093，R2=0.995 4;D2U35 豆豉 96 h，y=24.7620.4149，R2=0.978 1。從以上數(shù)據(jù)看出豆豉異黃酮提取物作用劑量與抑制率之間均呈現(xiàn)出良好的劑量-反應(yīng)關(guān)系、時(shí)間-反應(yīng)關(guān)系(圖4)［12］。隨著豆豉異黃酮提取物濃度的增加，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，異黃酮提取物對(duì)LLC細(xì)胞的抑制能力增強(qiáng)。說(shuō)明異黃酮提取物濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，抗腫瘤能力越強(qiáng)。

圖4 豆豉異黃酮提取物對(duì)LLC細(xì)胞抑制率的劑量-反應(yīng)曲線、時(shí)間-反應(yīng)曲線Fig.4 Dose-response curve of cell inhibitory rate of isoflavones on LLC cells

2.6 熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化

經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)后，培養(yǎng)瓶中己見(jiàn)不到貼壁細(xì)胞，鏡下所見(jiàn)均為飽滿的懸浮細(xì)胞。用Hoechst33342染液染色后，活細(xì)胞為明亮藍(lán)色，凋亡細(xì)胞更為明亮。

與對(duì)照組相比，D2、U35單菌豆豉和D2U335混菌豆豉的異黃酮提取物作用于LLC細(xì)胞作用時(shí)間24h時(shí)，細(xì)胞均呈現(xiàn)飽滿的圓形;48h時(shí)，細(xì)胞呈現(xiàn)較飽滿的圓形，細(xì)胞出現(xiàn)破碎;72h時(shí)，破碎細(xì)胞增加，活細(xì)胞數(shù)明顯減少;96h時(shí)，細(xì)胞幾乎全部破碎，并且活細(xì)胞數(shù)量非常少(圖5)。隨著豆豉異黃酮提取物作用于LLC細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，D2、U35單菌豆豉和D2U335混菌豆豉對(duì)LLC細(xì)胞抗腫瘤能力逐漸增強(qiáng)。

3 討論

分別用染料排斥法、MTT法和細(xì)胞形態(tài)法3種方法測(cè)定了LLC細(xì)胞存活率、LLC細(xì)胞抑制率以及熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化，得出結(jié)論:豆豉異黃酮提取物濃度越大，作用于LLC細(xì)胞的時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)LLC細(xì)胞的抑制能力越強(qiáng)。通過(guò)逐步回歸分析得出:異黃酮含量與LLC細(xì)胞腫瘤的抑制率成正比。對(duì)腫瘤抑制作用:苷元苷型異黃酮＞總異黃酮＞糖苷型異黃酮。

混菌豆豉苷元型異黃酮含量分別比D2、U35單菌豆豉高101.95 μg/mL 和35.48 μg/mL，是D2 單菌豆豉的2.38倍，是U35單菌豆豉的1.25倍。D2U35混菌豆豉對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率分別比D2、U35單菌豆豉高15.79%和7.02%。說(shuō)明混菌發(fā)酵不僅提高了苷元型異黃酮含量，還提高了豆豉提取物抗腫瘤能力。通過(guò)混菌發(fā)酵生產(chǎn)豆豉，提高苷元型異黃酮含量的同時(shí)提高了豆豉抗腫瘤能力，為將豆豉開(kāi)發(fā)成為新一代功能性食品提供重要的參考。

圖5 豆豉異黃酮提取物作用于LLC細(xì)胞不同時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)變化Fig.5 Morphologic change of LLC cells exposed to different treatments

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